小中大七、质粒的结合生殖(conjugation)
有的质粒具有在细菌细胞间进行结合生殖的能力,这些质粒称为结合质粒(conjugative plasmids)或自动转移质粒(self-transmissible plasmids)。质粒的结合生殖过程包含了细菌细胞间的结合与质粒的DNA复制。与质粒结合生殖有关的基因很多,其中包括主持其事的基因和许多调控结合生殖的基因。这些基因在不同的质粒系统中各有其名,但多数被命名为tra(Transfer)或mob(mobility),如traA、tra、mobA、mobB等等。一个结合质粒至少要具有下列三个基本条件:1.产生性线毛(sex pili)的能力、2.具有转移原oriT(origin of transfer)及3.能辨认oriT的特殊DNA内切脢(DNA endonuclease)。
结合质粒有产生线毛蛋白(pilin)的基因,线毛蛋白产生后组成性线毛。虽然性线毛因来源质粒不同而有F-线毛(来自F-质粒)、R-线毛(来自R-质粒)等之分,但在功能上它们的作用都是用来刺激细菌细胞使之结合。含有结合质粒能产生性线毛的细菌细胞称为雄型(male type)或正型(+ type);不含结合质粒无性线毛的细菌细胞称为雌型(female type)或负型(- type)。结合生殖时正型称为授株(donor);负型称为受株(recipient)。结合生殖的结果使负型变为新的正型,此时新的正型称为transconjugant(有些情况称为exoconjugant)。
质粒在结合生殖时要靠特殊的DNA内切脢将质粒DNA中的一股在特定的地方切成单链,然后将切成单链的一股DNA经由两个细胞的结合处传送到受株中,同时以rolling circle方式完成各股DNA的复制。质粒DNA中被切开的特定的地方就是oriT或称为bom(basis of mobility)、nic(nick site),它们具有一定的DNA序列。切oriT的DNA内切脢有时称为nickase,它是tra基因中之一的产物。每一类的oriT均有它特定的DNA内切脢,并且内切脢应该切oriT处的哪一条链及哪两个碱基之间也是一定的。
非结合质粒中有些因为具有oriT或bom,所以可以经由具tra基因的helper质粒协助而被传送。可被传送的非结合质粒称为可移动质粒(mobilizable plasmids),pBR322就属于这个类型;不可被传送者称为不可移动质粒(non-mobilizable plasmids),RSF1010属这一型。可移动质粒与helper质粒的搭配使用在基因转殖上是常被利用的技术。
结合质粒F上有若干个与大肠杆菌染色体上相同的转位子。在偶然的状况下因为相同DNA序列的转位子发生同源重组(homologous recombination),结果使F-质粒与染色体DNA融成一体。这种授株被称为Hfr(high frequency of recombination)。当Hfr的F-质粒做结合生殖时,整个与其黏合的大肠杆菌染色体会依序地被传送到受株中。大肠杆菌的基因图谱就是靠这种方式完成的。你也可以利用泛宿主性结合质粒在其它菌种中做类似的工作,但因DNA定序技术的高度发展已使得这类工作显得费时与不够精确了。
八、载体(vector)
载体的主要功能在基因选殖(cloning),选殖的主要目的是分离、纯化及繁殖特定的基因。细菌性载体主要有质粒载体(plasmid vector)和噬菌体载体(phage vector)两种,我们这里所谈的以质粒载体为主。质粒载体的基本条件是:1.它们是复制体,能生生不息地被复制;2.它们有适当的标示基因,可供做转形株(transformant)和非转形株(non-transformant)的辨识;3.它们有另一组具有限制脢单切点的标示基因,可供插入外来基因并做为选殖株(clone)和非选殖株(non-clone)的辨识。此外它们的基因体要小,以便于操作和细胞转形。
利用质粒发展成载体第一个最成功的例子是pBR322(Bolivar et al, 1977)。它含有pMB1的复制原、pSC101的抗四环霉素(tetracycline)基因tet和Tn3(一种转位子)的抗青霉素(penicillin)基因bla。你可以把外来基因插在这两个抗药基因中的任何一个内,利用中断抗药基因的消失做选殖筛选,利用剩下的一个完整抗药基因做转形株筛选。因为pBR322的成功构筑,才使基因选殖有了长足的进展。
细胞转形(cell transformaiton)是基因选殖的重点工作之一。但细胞的转形率与外来DNA的大小成级数反比。以几万碱基对大小的DNA来转形大肠杆菌细胞几乎是不可能的。为了改善这种情况,结合了pBR322的载体特性和噬菌体λ(lambda)的壳蛋白包裹(packing)特性发展出cosmid pHC79 (Hohn and Collins 1980)。噬菌体λ的基因体由48,502个碱基对构成。它在宿主中的DNA复制产物是多个λ基因体相连的多元体(concatemers)。当噬菌体壳蛋白接近完成时才将λ基因多元体由一端「吸入」。当壳蛋白已经包裹了约相当于λ基因体75%的DNA(约36,000碱基对)时,一个特殊的λ DNA内切脢开始被活化并寻找适当的切点以便切开λ基因多元体完成包裹动作。如果壳蛋白已经包裹了约相当于λ基因体110%的DNA(约54,000碱基对)还没发现适当的切点时,包裹动作就会被放弃。这个「适当的切点」平时就在线状λ基因体DNA的两端,称为 cohesive sites (cos)。将噬菌体λ的cos切出植入pBR322中使新构筑的载体兼有质粒载体与可被视为λ基因体而被包入λ壳蛋白中的特性,可使30,000~50,000碱基对大小的DNA轻易地被选殖出来。因为它结合了λ cos site和plasmid,故称为cosmid。