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标题:【讨论帖】抗菌肽的大规模生产

memory[使用道具]
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【讨论帖】抗菌肽的大规模生产


老板想把抗菌肽能大量生产,我们实验室曾经做过真核,表达不怎么稳定而且纯化方面遇到很多麻烦。然后我在用原核,选用的是融合表达。融合表达一方面不经济,另一方面在切割和下游纯化方面也遇到很多困难。单独表达又对宿主有影响,不知各位高人有什么好的建议?
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Ao7[使用道具]
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建议你选择原核的融合表达体系,我做过,抗菌肽产量很高,主要是设计选择好的切割和纯化体系,单独表达几乎是不可能的,就算是western blotting也检测不到单体表达的,基本认为无表达,你的抗菌肽是多大?我最小做过3.5KD的,可以成功酶切得到单体,并纯化。正准备发文。估计做产业化的话,要选择一个便宜好用的切割酶很重要,
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我做过抗菌肽的原核融合表达体系,很好作,不过就是要选择一个便宜高效的酶切体系,纯化也不难,最小做过3.5KD的抗菌蛋白。真核表达量本身就是一个很大的障碍,根本不能和原核相比的
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大规模生产恐怕难度大,我倒是觉得酵母表达会更好些,用融合表达的话,酶切是一个很大的问题,成本也会大幅升高,另外,酶切后的纯化呢?如何解决?再有,蛋白酶切一般不彻底,会不会影响活性?
酵母是真核细胞,表达有先天的优势,不利之处在于大多数表达量超低,另外,抗菌肽一般是小肽,电泳验证也比较困难,还有降解的问题,所以,我认为大规模生产,需要解决很多问题,如果真的都能克服了,那可的确是一个很大的突破了,我也希望能看到这样的突破
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flower-201[使用道具]
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我现在做毕赤酵母表达,进入表达阶段了,今天第一天诱导。
我想三天时再留样,对不同时间样品处理,有什么好方法和注意事项吗?
因为我想三天的样一起跑page
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wsll[使用道具]
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相对楼上建议要做的是
1,测量菌体的湿重,以更好的了解菌体生长规律。
2,开始时最好每24小时取样一次,从24小时开始,直到144小时,如果是胞内表达,离心后要及时制备样品,不能及时做-70度冰箱保存,对于分泌型表达,上清夜要放于-70度冰箱保存,最好进行浓缩。跑SDS-PAGE胶时如果培养基中加有磷酸缓冲液,最好进行脱盐处理。
3,毕赤酵母表达蛋白因为本身有蛋白酶,所以容易出现降解现象,最好有相应的抗体进行检测。
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flower-201[使用道具]
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蛋白如何浓缩?
我每次只有1ML样
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zzzz[使用道具]
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相对楼上建议要做的是
1,测量菌体的湿重,以更好的了解菌体生长规律。
2,开始时最好每24小时取样一次,从24小时开始,直到144小时,如果是胞内表达,离心后要及时制备样品,不能及时做-70度冰箱保存,对于分泌型表达,上清夜要放于-70度冰箱保存,最好进行浓缩。跑SDS-PAGE胶时如果培养基中加有磷酸缓冲液,最好进行脱盐处理。
3,毕赤酵母表达蛋白因为本身有蛋白酶,所以容易出现降解现象,最好有相应的抗体进行检测。

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磷酸缓冲液会影响PAGE电泳么?我曾经直接跑过,感觉条带还行,但我并不确定PBS是否对电泳有没有影响,希望有战友能帮忙解答一下。
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viviwang1987[使用道具]
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1ml样好办阿。
可以透析除盐后冷冻干燥,然后用适量的溶液溶解就好了。
注意:
1 要选好透析带:分子量范围应该在你的蛋白分子量3倍以上;
2 透析至少四小时以上,透析带外用双蒸水(体积越大越好),中间至少换三次。这一步是为了除盐,如果盐浓度过高,冻干过程中容易引起蛋白变性。
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wsll[使用道具]
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抗菌肽除了电泳检测表达以外,还有什么其他方法呢?
如果用抗体的话,应该如何选择呢?
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