【求助】western blot的分离胶不凝

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标题:【求助】western blot的分离胶不凝

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这一段时间做的western blot的分离胶总是不怎么凝，就是留在离心管（配胶的容器）里的胶不凝，或者只凝的很少，板里的胶用水封后能出现分界线，所以总体上还是能用。但是同样配的浓缩胶离心管里的就能够凝好。
自己分析了一下原因，可能是tris-hcl（室温存放）放的太久了，但是不知道他能不能影响胶。还有可能是屋里温度比较低不容易凝。还是丙烯酰胺（4度冰箱里避光存放）有了问题？
不知道大家遇到过这种情况么？

lxh031[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主先考查一下是不是温度的问题，方法很简单，再配胶的时候打空调到20度以上，这时候胶凝的就很快了。

TRIS-HCL保存的条件就是室温，没问题的。

凝固主要和AP与TEMED有关，如果丙烯酰胺没问题的话，试着增大一点TEMED的量，稍微多加50%，效果很明显。

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主先考查一下是不是温度的问题，方法很简单，再配胶的时候打空调到20度以上，这时候胶凝的就很快了。

TRIS-HCL保存的条件就是室温，没问题的。

凝固主要和AP与TEMED有关，如果丙烯酰胺没问题的话，试着增大一点TEMED的量，稍微多加50%，效果很明显。

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恩，可能和温度有关，但是有又发现了新的问题就是我配了一管胶，然后过了大概四十分钟之后胶凝了，但是胶上面浮了很多水，我问同学他们说一般胶都是刚好凝的没有很多水系出来，请问这样是怎么回事呢？是和丙烯酰胺有关么？我们的丙烯酰胺用的是百分之三十，4度避光保存。
还想请问一下temed是该4度还是常温呢？

49888[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

增大TEMED的同时一定要加大10%AP的量，10%AP一定是TEMED的是10倍，否则还是不凝

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

增大TEMED的同时一定要加大10%AP的量，10%AP一定是TEMED的是10倍，否则还是不凝

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AP是用的25微升，temed是5微升，加的少么？

ending[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你AP加少了，我的配方里面TEMED为5uL的话，AP在分离胶和浓缩胶里分别为75uL和50uL，所以凝的慢啦。TEMED可以室温保存的，楼主先看看试剂标签上的说明，RT就是可以放在室温啦。
水什么的无所谓啦，只要你按配方加试剂，没问题的。但是强烈怀疑楼主的配方不对，你贴出来看看。

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ending 于 2013-5-24 17:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你AP加少了，我的配方里面TEMED为5uL的话，AP在分离胶和浓缩胶里分别为75uL和50uL，所以凝的慢啦。TEMED可以室温保存的，楼主先看看试剂标签上的说明，RT就是可以放在室温啦。
水什么的无所谓啦，只要你按配方加试剂，没问题的。 ...

可是以前也是一直按配方配的，也没什么问题，配方
百分之10的分离胶10ml的话
水 4.05ml
百分之30的丙烯 3.3ml
tris-hcl8.8 2.5ml
百分之10的sds 100ul
AP 50ul
TEMED 10ul
你们的配方是怎么样的呢？
水的量多少都没问题么？
tris-hcl的ph不好有关系么？

ending[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

服务楼主，把自己的配方贴一下

10%分离胶，5%浓缩胶

分离胶

浓缩胶

水

3.0mL

2.85mL

30%丙烯酰胺

2.475mL

0.85mL

买

1.5M Tris(ph8.8)

1.85mL

买

0.5M Tris(ph6.8)

0.85mL

买

10% SDS

75μL

50μL

自制

10% APS

75μL

50μL

临用现配

TEMED

5μL

5μL

买

这是配两块胶的配方，很明显，楼主你的AP加少了，所以胶凝的慢。自己按照比例换算一下吧。还有一点，AP很容易失效的，所以我都是临用现配，失效的话就凝不了啦。
Tris最好买试剂公司的预混液，很方便，自己配的Ph不准。

kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

AP是用的25微升，temed是5微升，加的少么？

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这是几块胶的量？这种天我们一般一块胶5~6微升TEMED 10%AP是TEMED的10倍
另外板里的胶确实比烧杯的凝得快

kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-5-24 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是几块胶的量？这种天我们一般一块胶5~6微升TEMED 10%AP是TEMED的10倍
另外板里的胶确实比烧杯的凝得快

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一块分离胶的，一共5ml，我试着多加点AP吧~