【求助】做WB时为什么背景很深

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标题:【求助】做WB时为什么背景很深

toy[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚做WB，抗体用的是师兄留下的，当时买的是santa公司的，这是昨天做的两张图（都是跑的目的蛋白，没有上内参），左边都是maker,然后实验室的说：这不是正常现象，他们说从来没有碰到。我也很郁闷！而且背景很脏、、、步骤基本如下:1.封闭液用的是含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1小时。2.我1抗的浓度是1：200，4度孵育过夜。3。2抗都是1:5000室温孵育一小时、4.其他的基本洗涤都是1XTBST洗三次，每次十分钟。就这些，希望各位高人指点小女子、、、帮忙给点建议！谢谢各位、、、

附件

2013-5-25 15:22

13109244.snap.jpg (36.01 KB)

kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图看不清，不过感觉是封闭问题。封闭后不要洗三次，用TBST把膜上的封闭液冲掉就行了。

还有就是看一下二抗是不是要求用脱脂奶稀释

toy[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #2 kuaizige 的帖子

我们二抗是用脱脂奶粉1:5000稀释的，今天试试你说的封闭后不洗三次看看再说，谢了O(∩_∩)O~

IAM007[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1，适当延长封闭时间

2，增加一次洗涤次数（4次）

3，稍微稀释二抗（1:8000）

toy[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #4 IAM007 的帖子

你好、我问了下其他的做WB的战友，他们也说可以延长封闭时间，这个我也在该进！我有个问题：封闭后洗4次会不会太久？会不会把封闭的奶粉洗脱啊？有的战友建议封闭后稍微冲洗一下就可以，然后上一抗4度过夜，我还刚做不久，对于WB的问题还有很多不懂的，提的问题不好，不好介意，望回复！谢谢学长、、、

toy[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 kuaizige 于 2013-5-25 15:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

图看不清，不过感觉是封闭问题。封闭后不要洗三次，用TBST把膜上的封闭液冲掉就行了。

还有就是看一下二抗是不是要求用脱脂奶稀释

可能昨天覆一抗时间太短，显影没有结果！不过还有一批覆4度过夜的结果晚点会出来，希望能好看点！谢谢学长指点、、、

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发表于 2013-5-25 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好、我问了下其他的做WB的战友，他们也说可以延长封闭时间，这个我也在该进！我有个问题：封闭后洗4次会不会太久？会不会把封闭的奶粉洗脱啊？有的战友建议封闭后稍微冲洗一下就可以，然后上一抗4度过夜，我还刚做不久，对于WB的问题还有很多不懂的，提的问题不好，不好介意，望回复！谢谢学长、、、

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封闭本身的目的是封闭掉多余的结合位点、封闭完成后直接孵抗体、不需要进行洗涤。

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好、我问了下其他的做WB的战友，他们也说可以延长封闭时间，这个我也在该进！我有个问题：封闭后洗4次会不会太久？会不会把封闭的奶粉洗脱啊？有的战友建议封闭后稍微冲洗一下就可以，然后上一抗4度过夜，我还刚做不久，对于WB的问题还有很多不懂的，提的问题不好，不好介意，望回复！谢谢学长、、

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室温blocking30min足够了
背景主要由抗体本身决定的
santa的抗体不敢恭维
除却抗体本身因素

1抗4度8h
TBST洗1抗20min 2次
二抗1：1万或者5k 室温30min
TBST洗2抗20min 2次
基本上背景很好的

superboy[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我遇到这种情况一般会重新把膜用洗干净，然后再次分别加入一抗、二抗，然后重新曝光，效果可能会不一样的！

toy[使用道具]
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发表于 2013-5-25 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

室温blocking30min足够了
背景主要由抗体本身决定的
santa的抗体不敢恭维
除却抗体本身因素

1抗4度8h
TBST洗1抗20min 2次
二抗1：1万或者5k 室温30min
TBST洗2抗20min 2次
基本上背景很好的

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嗯、谢谢啦！谢谢你们的意见，我现在还是打算封闭久一点！

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