蛋白质与蛋白组学

1，电泳跑的不错，条带清晰；
2，没有摇床静置培养，即使所有的其它的东西都是正确的，表达肯定不会好的；
3，“但是上清用化学发光法测定有高浓度的目标蛋白。”你这个上清是什么上清？跑电泳的上样液？还是培养的物的上清？如果是后者，该是分泌表达，你拿菌体破碎物做出电泳条带，那才奇怪。如果是前者——你电泳上样的样品不是菌体用Loading buffer悬浮煮沸的吗？怎么做化学发光？
4，“做了很多次page。每次空白跑出来和目的菌一样的，根本找不到目的条带，仪器是biorad电泳仪。
目的蛋白大约为37kd。
条件如下：
1.从含目的质粒的原始菌株接种到LB固体培养基”
是不是应该写成：……每次目的菌跑出来和空白菌一样……将含目的质粒的原始菌株接种到LB固体培养基”。呵呵

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1.谢谢！我是新手，基本没经验，都靠自己摸索在搞。
2.没办法。临床的就是这么悲催，毕业论文。科室条件简陋。
3.上清是我裂解离心菌体后得到的上清，沉淀用PBS溶解。我做的是肌钙蛋白T，用罗氏化学发光测上清和沉淀都能测到高浓度的肌钙蛋白T，空白菌测出来的有肌钙蛋白T，但浓度很低，但每次跑出来都和空白菌差不多。没有找到多出的条带。怀疑产生包涵体，我也试过用8M尿素溶解过沉淀，跑出来在37KD附近的条带深一些。如下图，第二、第三泳道是空白菌，第二泳道是空白菌沉淀，第三泳道是空白菌上清，第四泳道是目标菌沉淀用8M尿素溶解。
4，呵呵，我没怎么仔细看，大概是那么个意思。

这种问题很常见，可能有几个原因：
1.你的质粒构建有问题，可能有突变等什么原因，不知你构建成功后有没有测序验证？
2.你的质粒在你的诱导条件下不表达，部分蛋白不知什么原因不表达或表达量太低，导致很难肉眼观察到。
你可以向某些战友说的用western检测，也可以直接用亲和柱强行纯化，看能不能得到蛋白。
如果能检测到微量表达，你可以尝试不同培养条件，宿主细胞、载体等，增加蛋白的表达。

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1.质粒是别人帮我构建的，经过了测序验证。他也将质粒转进细菌做过预实验，可以清晰的看到目的条带。
2.这个我也觉得有可能，是不是有可能正好和目的蛋白重叠了，导致掩盖了目的条带？我的质粒是加了HIS标签,买了QIAGEN公司的HIS-TAG纯化试剂盒，活性条件下纯化的不好，很郁闷。我现在正在尝试变性条件下纯化，不知道怎么样，今天才跑了PAGE，明天早上去看结果。如果不行，我这周再坐下western。没有其他办法了。
3.非常感谢你。

有抗体的话做个western把，cbb条带太多，分不清的。

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恩，谢谢，我准备坐，只是二抗还没到，cbb是什么？

”上清用化学发光法测定有高浓度的目标蛋白“， 是用特异性抗体做的WB吗？

如果上清用western blot做出来了，建议用TCA或者硫酸铵将上清沉淀后，再跑电泳。

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我做是肌钙蛋白T,上清是我用菌体裂解后得到的，沉淀和上清是罗氏化学发光法都能的都很高的肌钙蛋白T。

western还没做，准备这周做下试试。硫酸铵沉淀上清？是直接加在上清里面吗？