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标题:【求助】Caspase-3小分子量的怎么老不出来？

jingling845[使用道具]
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发表于 2013-5-25 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Caspase-3小分子量的怎么老不出来？


请高人指点下：我做westernblot Caspase-3全长的35kd的可以出来，为什么小片段的17kd怎么老不出来？我用的是10%和8%的分离胶都跑过，抗体是cell signaling公司的。
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发表于 2013-5-25 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

35kd 用12的胶吧
估计跑出去了
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tuomu45[使用道具]
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发表于 2013-5-25 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也正在跑这个，有同样的疑问，顶一下~ 请问楼主用什么方法转的？条件如何？
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发表于 2013-5-25 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

17kD的可以用15%的胶，150mA60min,我经常做没问题
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-5-25 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胶浓度太低了，提高胶浓度
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jingling845[使用道具]
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发表于 2013-5-25 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

35kd的我是用10%的跑的，难道17kd的要用15%的跑，分开来跑？
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2013-5-25 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的Caspase-3激活没？
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发表于 2013-5-25 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
12%的SDS-PAGE可以都跑出来，没有问题的，除非是你的样品问题本来就没有17KD那一条
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-5-25 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我现在也在做caspas-3做了有几次了，一次也没做出来，我也是想要17KD的，我用的是15%的胶电泳时跑分离胶是用的100V，浓缩胶60V，转膜是0.8mA每平方厘米，转22分钟，可以看到maker已转上去，一抗也是cell signaling公司的，1：1000用封闭液稀释，一般作用是几个小时，二抗1：5000稀释，作用一个小时，我做的B-actin条带都可以，有时候还有些非特异性条带，就是没有目的条带，没用丽春红染过，我提的是组织的总蛋白，蛋白浓度还可以，我每孔加15微升，但电泳跑着跑是就跑到一起去了，根本看不出哪个是哪个，看不出泳道啦，而且拖尾很厉害，溴酚蓝要拖很长的尾巴，请大家帮我分析一下，谢谢啦
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发表于 2013-5-25 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Caspase-3是细胞凋亡过程中最关键的执行分子(key executioner)之一，可以剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白，例如PARP。Caspase-3的激活需要从没有活性的全长Caspase-3(35kD)，在Asp28和Ser29之间及Asp175和Ser176之间进行剪切，产生有活性的17kD亚基和12kD的亚基。
Caspase-3的激活常被作为细胞凋亡的一个重要指标。

所以，首先要确认你的处理是不是引起凋亡，引起Caspase-3的激活。
胶浓度低也是一个问题。
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