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标题:【求助】免疫共沉淀的重轻链问题

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】免疫共沉淀的重轻链问题

我现在要做免疫共沉淀了，可有个问题搞不明白了。我手里的两个蛋白抗体都是兔源的，就是说用他们两个做IP和western肯定会涉及到显影后的重轻链条带。可恨的是我的两个蛋白分子量一个25KD，另外一个52kd 左右，那怎么才能去除重轻链的影响呢？要是跑非还原胶重轻链应该多大分子量呢？那怎么处理IP后的样本，保证我的蛋白分开，重轻链有不解聚呢？可能么？谢谢！
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果跑非还原SDS胶的话,igG的分子量应该是150KD
但是你还有两个蛋白呢,它们有多少二硫键呢?
而且涉及IP和WB所用抗体的特异性问题,更说不清楚.

要去除重链轻链的影响,解决的方法还是有的:
1.用兔的igG做对照
2.用抗Fab和Fc抗体特异性封闭轻链和重链
3.在WB二抗上下工夫,这种二抗针对的是轻重链间的二硫键,所以如果跑SDS胶,最后显影是检测不到轻链和重链的,
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
明天去实验室再看看我的二抗适不适合。我见别的网友说新版分子克隆上说：“在上样buffer中不加巯基乙醇和dtt，100℃保温5min，抗体不解离下来，离心取上清，补加巯基乙醇，可以电泳了。”您看可行么？再次感谢！！
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的这个问题困扰了不少人，轻重链对目的蛋白的影响，如果你用Protein A 或G来做沉淀用的二抗，WB还会有Protein A或 G造成的杂带的影响。楼上的建议的几种方法理论上可行，但是实际操作起来难度和消耗都较大，
第一，你需要购买几种特殊的抗体来做封闭用，封闭的效果，很难预测。
第二，WB用特异的二抗，这个市场上不一定有卖，即使有也一定价格不菲。
第三，假如这些条件你都具备了，你要对这个实验进行很好的条件优化，要想得到一个好的结果，我认为没有十次、八次的WB是作不出来的。
以前我也遇到你这个同样的问题，后来是买个试剂盒搞定的。
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 89tongzijun 于 2013-5-27 16:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
明天去实验室再看看我的二抗适不适合。我见别的网友说新版分子克隆上说：“在上样buffer中不加巯基乙醇和dtt，100℃保温5min，抗体不解离下来，离心取上清，补加巯基乙醇，可以电泳了。”您看可行么？再次感谢！！ ...

这个方法没有试过，我认为你的反应条件如果能使抗体不从沉淀上解离下来，那么相应的应该也很难保证你的目的蛋白从一抗上解离下来，或者至少是解离不充分。这样会使你的WB结果大打折扣。
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
kewen2 wrote:
我见别的网友说新版分子克隆上说：“在上样buffer中不加巯基乙醇和dtt，100℃保温5min，抗体不解离下来，离心取上清，补加巯基乙醇，可以电泳了。”

=========================

SDS loading buffer without DTT?
当然都解离下来了.
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也觉得挺有难度的，但抗体是很早之前买的。而且国内没有分装，买的santa的原装。要是再买一个抗体太说不过去了，我今天开始实验了，但对结果没有什么信心。郁闷！请问baitao1979战友，买的什么试剂盒呢？我也去查查，找条出路。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天预试验显示不相关的抗体的重链，和我要的52KD蛋白在同一位置（拿了一个未IP的样本比对了），用未变性IP的样本重链位置变了，可我要的蛋白位置也变了，不知道那条才是了，这也在意料之中。可是没见到25KD处的轻链条带呀，8个CO-IP的样本都没有，难道重轻链显示比例不一样么。请道高的战友指点一下。谢谢啦！
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发表于 2013-5-27 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有位兄台说"后来是买个试剂盒搞定的"，不知道是哪个公司的何种试剂盒？可否提供相关购买信息？不知道价格是否能接受。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-5-27 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我看CO-IP说明说必须是未经冻存的蛋白样品。我的蛋白样品经过-80冻存了，是不是肯定不行了呀。因为根本检测不到复合物存在的迹象。实验过程肯定没问题，用未IP的样本作了对照的。那我的组织标本都冻过了，现提蛋白再做还行么，因为我的标本是人的手术切除标本，只能取回冻存。难道我CO-IP不能做了么，摸索条件也太费抗体了。高手出山指点我一下吧。谢谢！！！
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