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标题:【求助】如何去掉蛋白提取中的脂肪？

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-5-27 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何去掉蛋白提取中的脂肪？


提取蛋白已经有一段时间。现在换了组织标本，用的脂肪肝细胞。在蛋白提取过程，最后离心部分，发现出现三层：底层-细胞碎片，中层-蛋白，上层-脂肪。用枪头吸蛋白层时，脂肪总是会粘在枪头并跟蛋白层液体一起吸进去。不知道，园内是否有人能够解决这个问题。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-5-27 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

方法一，离心除去底层-细胞碎片，然后作硫沉，离心弃上清（脂肪也会在里面）。沉淀溶解后就是要的蛋白质。
要是样品量过小或者蛋白质没有办法作硫沉，那就用方法二。
方法二，找一个干净的玻璃丝棉或者滤纸将上清过滤，这样就可以除去里面的脂肪了。
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发表于 2013-5-27 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用0.22um滤膜 离心五分钟 脂肪就被滤掉了 很干净
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-5-27 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
方法一，离心除去底层-细胞碎片，然后作硫沉，离心弃上清（脂肪也会在里面）。沉淀溶解后就是要的蛋白质。
要是样品量过小或者蛋白质没有办法作硫沉，那就用方法二。
方法二，找一个干净的玻璃丝棉或者滤纸将上清过滤，这样就可以除去里面的脂肪了。

============================================================

样品量确实是很少只有300ul，这样也能用方法二吗？能用的话，能不能具体点说。
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-5-27 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用0.22um滤膜 离心五分钟 脂肪就被滤掉了 很干净

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你说的滤膜，可以放到1ml的EP管里离心吗？怎么操作，能否详细点
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-5-27 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
方法二，找一个干净的玻璃丝棉或者滤纸将上清过滤，这样就可以除去里面的脂肪了。
具体方法：
找一个 1ml 枪头，再找一团棉花（要是灭菌的就直接用，要是没灭菌的就先用75%洗一洗，然后用提取蛋白的buffer浸泡）。
将棉花塞在1ml枪头中，再用buffer预洗一下。然后将提取的蛋白质脂肪混合物加入枪头中，让混合物自然流出就行了，下面用EP管接着，最好EP管放入冰中，防止蛋白分解。
备注：1. 棉花的量要注意，不能太多。太多了流速比较慢，可能会堵死的。量也不要太少，防止棉花掉下来或者脂肪漏出来。
2.注意棉花要提前处理好，不要混入新的杂质或者其他蛋白分解酶什么的。
最后：以上意见参考一下，这个没有标准操作，是我自己想得，但我认为可行性很高，只要能达到我们试验的目的就行了。你也想想，总有办法的。
其实用0.22um 或者0.45 um的膜过滤可很好，但是你的样太少了。
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发表于 2013-5-27 18:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的滤膜，可以放到1ml的EP管里离心吗？怎么操作，能否详细点

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呵呵 说的不准确 是离心过滤管

工作体积500μl，离心管规格2.0ml 直接离心即可


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发表于 2013-5-28 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个帖子太好了

我因为要提取胸腺组织中的蛋白，也出现了很多脂肪组织，愁的不行！！

非常感谢SUNNYXIA,JEROMECUI等的热心回答，也感谢LILYMILLIE的问题

不知道楼主现在实验成功了否？也提供一些经验以作参考啊，哈哈

还有点细节想问下大侠：

JER提到的离心过滤管是否是将超声粉碎好后的组织直接放入过滤管中离心？还是将第一次离心好后的上清放入过滤管中离心？离心时间为5min，那么

转速为多少？多次离心会不会使蛋白含量下降？

SUN提到的小棉花团，大概体积是多少呢？

呵呵，不好意思，非常感谢！
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sr9971[使用道具]
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发表于 2013-5-28 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SUN还提到“其实用0.22um 或者0.45 um的膜过滤可很好”。

是不是就用 过滤无菌溶液时用的 针头过滤器来过滤即可？
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-5-28 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做脂肪细胞，遇到同样的问题。

LILYMILLIE 和弓长张的实验有结果了吗？用的离心过滤管还是针头过滤器？

谢谢！期待中......
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