小中大【求助】heLa细胞mTOR 分子的western blot
想检测hela细胞中mTOR 分子的表达和磷酸化情况，western blo实验做了3次，可是都没有目的条带，很是着急，还请各位帮我分析下啊～～
磷酸化的mTOR或许不好检测，可是我的mTOR的条带也没有，感觉就是很奇怪了。一抗说明书上显示mTOR 235KD, phospho－mTOR 289KD（说明书中phospho－mTOR是293细胞的，289kd，mTOR是大鼠肝脏中的，235kd，热心的iris_palm版主回帖说这个可能是由于组织特异性）
下面是我实验的具体步骤与试剂，各位大侠帮我分析下啊，不胜感激
1.mTOR的一抗是abcam公司的，phospho-mTOR的一抗是cell signaling公司的，二抗是荧光二抗。
2.实验步骤：
1） sample buffer 在60mm皿中裂解细胞，刮板将细胞刮下，吸到1.5ml EP
管，用1ml注射器枕头抽吸细胞，破碎DNA，沸水浴5min。－20度冰箱保存。
2) 电泳 浓缩胶4％，分离胶6％。先是50V跑过浓缩胶，130V电泳3h。上样量是200ug。
3）转膜 pvdf膜，100V，3.5h。
4）5％脱脂奶粉封闭2h。
5) 一抗用脱脂奶粉1：1000稀释4度过夜。PBST洗膜，3次每次5min
6）二抗脱脂奶粉1：5000稀释，室温1h。洗膜，4次，每次5min。
补充一下：
1.本人用的试剂药品荧光二抗之类的应该没有问题，前些天成功地检测到了AKT和phospho－AKT。
2.转膜时marker最大 175kd的，可以转过去的。
3.蛋白胶跑过了，考马斯亮蓝染过，有条带的。至于蛋白上样量，因为觉得这个蛋白的含量可能比较低，所以多加了些。我的蛋白浓度是用nanodrop的仪器测的，当然可能蛋白浓度不是很准，所以就有意多加了些。
4.阳性的话我也考虑过。mTOR的抗体是abcam公司的，推荐
rat liver lysate 做阳性对照，可是这个我没有，phospho－mTOR的抗体是cell
signaling 公司的，它的图是用293细胞饥饿16h做的，其中一张图是染的mTOR。我们实验室不做大鼠，所以我用293细胞，不加血清的DMEM培养基处理16h做的阳性对照，也是没有条带。不知这算不算是阳性对照呢？？
5.其实也是看到一篇文章中用过这两个抗体才订的。那篇文章结果还可以的，是我们老板一年前在的实验室发的，所以方法什么的应该也没有太大关系，可是我做的就是没有条带，很是郁闷……
还有我想请教一下
1.转膜完了，胶用考马斯亮蓝染色，不管做哪个蛋白好像总是marker转的最彻底，这是什么原因呢？？
2.关于蛋白样本的反复使用问题 我一直在想蛋白样品煮沸之后－20度保存的时候会不会也会使某些蛋白降解啊？？即使分装开了，每次拿一管出来用，那剩余的样本即使没有反复冻融会不会也有可能降解掉？？
再另：我们实验室几个月前有人买了santa cruze的抗体，wb做了好多次都没有条带，后来向一篇文章的作者要了他们自己做的抗体就染出条带了。联系代理公司又给他们换了一支新的抗体。我的抗体是不是会有问题啊？？担心，大把的时间浪费在上面的>_<
附件照片是我的结果
