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标题:【求助】关于检测PKC和PLC磷酸化的western

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-30 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于检测PKC和PLC磷酸化的western

我做pkc、plc磷酸化的western，做了好几次，什么结果都没有。连背景都干干净净！不知道问题出在哪里，现将我的实验全过程简述如下，请有经验的战友指点一二：

1，  制备蛋白样品：刮刀从平皿上刮下细胞，低温800rpm离心5min，去上清。8×106 cell加入200ul单去污剂裂解液，冰浴裂解20min。加入5×loading buffer，沸水煮10min。常温12000rpm离心10min，取上清电泳。
2，  电泳：每孔上样40ul，120v 30min浓缩，160v100min分离。
3，  转膜：130mA（2.5mA/cm2膜），半干转移150min。丽春红染色，蛋白已经转移上（是否完全转移就不一定，有时将转过的胶染色，还有小部分未转出。）
4，  免疫检测：
封闭：5％脱脂奶，室温2h（或者4度过夜）
一抗：cell signaling的一抗，1：1000和1：200都做过，室温1h、2h、3h或者过夜都做过。TBST洗10min＋5min×2
二抗：1：1000和1：200都做过，室温1h、2h都做过。TBST洗10min＋5min×2
发光：将膜用滤纸吸干水，用ECL发光反应，曝光。
5，  结果：基本上连背景都没有，胶片上干干净净！

6，查原因：做过ECL和二抗的发光反应，正常。现在还换了一支新的二抗。

疑是一抗的问题，检测PKC磷酸化情况，用的抗体是抗所有PKC磷酸化的其他蛋白的磷酸化位点，所以很多蛋白都该有显示条带，但什么都没有。但一抗是直接从美国买的，cell signaling的产品，在我们实验室－20度冰箱放了大半年，应该不是买了太久没用的缘故吧。看资料抗体可以在此情况下保存很久活性降低不多啊。
做了这么多次都这样，真是绝望。盼高手指点啊。
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发表于 2013-5-30 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你做个内参，以检测你整个实验过程有无问题
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发表于 2013-5-30 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么做内参照？什么意思？麻烦详答。
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发表于 2013-5-30 10:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是否试过显影定影液？做磷酸化个人认为用PVDF膜比较好，不知道什么原因。
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发表于 2013-5-30 10:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

显影液定影液没问题。
PVDF膜会好点吗？没试过。
只是觉得我的检测对象是非常广的，就算不刺激，也有很多本底的啊。结果什么都没有。
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发表于 2013-5-30 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

要不换换抗体试试，全换！
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发表于 2013-5-30 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是cell signaling的抗体.
有没有国产的抗体，比较好用的，检测PKC和PLC磷酸化情况的。
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发表于 2013-5-30 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能在语言的表述上的差别，我还没有搞清除你的一抗和要检测的目的蛋白到底是什么，是检测pkc还是检测被pkc磷酸化的底物蛋白呢？
对于你做western的整个体系我看没有什么问题，一些细节你也没有说，你有没有尝试过用action的抗体在这个体系中有没有条带出现呢？这种抗体国内就有，我想你最好还是尝试一下。
你的裂解液中加了蛋白酶抑制剂了吗？对于这种丝氨酸的磷酸化我没有做过，在文献中有没有磷酸酶的抑制剂呢？
其实二楼说的内参的问题就是检测你的整个体系中有没有问题，尽快尝试一下！
你说的发光发应正常是怎么回事呢？如果发光能持续多长时间呢？在暗室中压片的时候你能看见绿色的荧光出现吗？
还有你用的x光片，是否已经曝光了呢？
说的很罗嗦，希望对你的实验有帮助！
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发表于 2013-5-30 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的朋友！

对于PLC，我是检测PLC的磷酸化情况。对于PKC，是检测PKC磷酸化的底物蛋白的磷酸化情况。
有action的抗体，也是去年夏天买的cell signaling 的，还没有试过，我会尽快尝试。
裂解液中加了蛋白酶抑制剂（常用的三种）和去磷酸化抑制剂（氟化纳和叠氮钠）。
关于内参，就是不懂怎么做，是什么意思？检测ACTION，算不算内参？

检测二抗和ECL,我是将二抗直接点在NC膜上，干后，暗室中用ECL检测，有很强绿色荧光。X胶片也无问题，在检测二抗中，胶片上就有二抗发光的点(这个倒是圆圆的，挺漂亮，郁闷）
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 小中大

另想请教，检测磷酸化蛋白的western中，膜可否striping后再用，会不会在striping的过程中，去磷酸化了？
如果可以的话，这些膜怎么保存呢，放TBST中浸泡置4度可以吗？可以这样保存多久呢？
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