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标题:【求助】Western检测TNFa、TGFb的问题

damingxia0904[使用道具]
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发表于 2013-5-30 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western检测TNFa、TGFb的问题


PVDF膜经染色后发现10－50kDa的蛋白都已经成功转到膜上，但是Western就是检测不到信号。用相同二抗的actin也能检测到条带。说明转膜之前及加二抗之后都没有问题？
那是不是只能是一抗的问题了？
我们用的一抗是：
TNFa，Santa Cruz，sc-1350
TGFb，Santa Cruz，sc-146
不知这两个抗体有战友用过吗？请高人支招！谢谢！
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popo520[使用道具]
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发表于 2013-5-30 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗有可能没有问题；转膜也没有问题！建议楼主考虑一些蛋白提取的问题，有可能根本没有提到你想要得蛋白！祝成功！
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2013-5-30 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上您好！能详细说说吗？actin都提到了，我还检测过别的20kDa的蛋白，也能检测到。为什么就没有TNFa和TGFb？提取这两个蛋白需要注意什么问题？谢谢！
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popo520[使用道具]
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发表于 2013-5-30 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这两个蛋白是膜蛋白吗？如果没有记错，他们似乎是在膜上表达？如果是膜蛋白，国内没有可以提膜蛋白的试剂盒，建议你选用pierce的专用膜蛋白提取试剂盒，价格比较高，可能要2500元，祝好运！
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2013-5-30 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
骨折心力衰竭
你好，TNFa和TGFb均属于细胞因子/生长因子，是分泌表达的，而不是膜蛋白。

转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β)是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β。在体外，非活性状态的TGF-β又称为latency associated peptide（LAP），通过酸外一时可被活化。在体内，酸性环境可存在于骨折附近和正在愈合的伤口。蛋白本科的裂解作用可使TGF-β复合体变为活化TGF-β。TGF-β是由两个结构相同或相近的、分子量的12.5kDa亚单位借二硫键连接的双体。人TGF-βcDNA序列研究表明，单体的TGF-β112氨基酸残基是由含400氨基酸残基的前体份子（per-pro-TGF-β)从羧基端裂解而来。pre-pro-TGF-βN端含有一个信号肽，在分泌前被裂解掉，成为非活性状态的多肽链前体（pro-TGF-β)，通过改变离子强度、酸化或蛋白酶水解切除掉，成为非活性状态的多肽链前体（pro-TGF-β)，通过改变离子强度、酸化或蛋白酶水解切除N端部分氨基酸残基，所剩余的羧基端部分形成有活性的TGF-β。TGF-β1与TGF-β2有71%氨基酸同源性，TGF-β1与TGF-β3有77%同源性，TGF-β2与TGF-β3有80%同源性。

TNF-α又称恶液质素，是由激活的单核/巨噬细胞分泌的一种具有多种生物活性的细胞因子，与受体结合能产生多种生物效应，如免疫刺激、调节机体的抗菌作用、蛋白激酶C的激活和涉及多种炎症、细胞生长的基因表达的激活.TNF-α可分为跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α，主要由激活的单核/巨噬细胞产生，活化的T细胞、NK细胞和肥大细胞也可产生、分泌TNF-α，心肌细胞等多种非免疫细胞在某些应激状态下（如心力衰竭）也具有产生TNF-α的能力，目前认为心、肝、肺、肾是TNF－α生物合成的主要器官。跨膜型TNF-α的一级结构有233个氨基酸残基，-76～-1位为引导肽序列，该序列中-1～-70位连接段，-21～-46位是疏水区域，可形成跨膜段，其余部分为胞内段。在金属蛋白酶TACE作用下，跨膜型TNF-α胞外段1～157位可被水解，脱落为分泌型的TNF-α，分泌型TNF-α释放入血发挥作用.TNF-α的生物学功能是通过细胞表面的相应受体介导来实现的。TNF-α受体分两型，即TNFR1和TNFR2，他们同属于一个受体超家族，即TNF受体超家族。TNFR1和TNFR2的细胞外部分则由182个和235个氨基酸残基构成，两者都由具有高度序列同源性的半胱氨酸结构构成，但是在细胞内的结构域却未显示出序列的同源性，提示两种受体激活有着不同的细胞内径路。不同细胞每种受体作用还未明确，但大多数人认为TNF-α的大部分生物活性是由TNFR1所介导，包括细胞毒性、纤维细胞增殖、抗菌、前列腺素E的合成、抗病毒和超氧化物歧化酶的诱导，而TNFR2主要介导T细胞的增殖、皮肤坏死、胰岛素抵抗等。
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发表于 2013-5-30 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚刚接触TGF，课题设计中，想做药物干预后，肝脏内TGF及其受体的量有无改变，不知道楼主能否给予指导，谢谢！
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发表于 2013-5-30 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

is your TNFa a mouse TNF? another thing is how is your dilution? seems this paper
J Virol. 2005 December; 79(24): 15405–15416
(polyclonal goat antibodies that recognize murine TNF-α (sc-1350, diluted 1:500 [Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA], )
can tell you something.
did you use anti-goat secondary antiobody?
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2013-5-30 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的western TGF一直做不出来，正在想办法解决，等解决了之后再给你建议吧。
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damingxia0904[使用道具]
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发表于 2013-5-30 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这篇文章我看了，他们没做western，做的是免疫染色。我们用的二抗是Zymed的HRP-兔抗羊二抗，没有错。。。还是谢谢你！
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-5-30 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的actin做出来效果怎样，如果是非常浓，或者说你改进了条件，做出来的actin一般浓。总之如果actin是非常容易做出来，而且量很高，说明你提蛋白应该没有问题。可以考虑抗体的问题。直接去公司质询，国外公司的抗体有问题是非常正常的。
如果你的actin是勉强做出来的，条带很淡、或扩散严重。那么就要仔细考虑western的整个步骤，做实验中的每一步都有可能出问题。最主要的是提高上样量。因为actin能做出来，大致的实验步骤应该没有问题。
因为actin是非常好做的蛋白，所以actin 做出来，能说明的问题其实非常有限。另外，你做的两种都是分泌蛋白，不知道做的是组织还是细胞，可能提取的方法是不一样的。呵呵！
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