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标题:【求助】WB前一定要做蛋白浓度测定吗?

am10[使用道具]
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【求助】WB前一定要做蛋白浓度测定吗?

请教各位,网站帖子总结了下测蛋白浓度的目的基本上是为了保持上样量的一致,而且可以知道上样量的多少。但是有如下问题想请教下:
1:上样量一致得出的结果应该是直接比较的,但是测蛋白浓度后还是有很多的步骤的,比如煮沸就会改变蛋白浓度,还有放置时间问题,这样的话测出的结果是和总蛋白浓度比较比较可靠呢还是和内参比较比较可靠呢?有的说两个都可以,但是我做出来的结果并不是很一致又该怎么办呢?
2:我看到很多文献里包括国外的有关WB的实验中并没有测蛋白浓度这一项呢,是大家都默认不写还是什么原因,既然不写也可以是不是大家都默认和内参比较的结果比较可靠?


[ 本帖最后由 am10 于 2013-5-31 10:26 编辑 ]
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wmp1234[使用道具]
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WB本来就是半定量,不用考虑这么多了。
做之前当然要做蛋白质定量了,这样可以使内参差不多一致,做出的结果才能漂亮。
具体表达量的比较,还是要以内参做比较的。
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am10[使用道具]
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哦,那就是说在实验科学性上来讲的话不做是没有问题的?
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cocacola[使用道具]
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从做了很多WB的经验来说,测浓度是为了大致确定上样量,最终要根据内参来衡量上样量的一致性,最准确的是测OD值,将内参和目的蛋白进行比值比较。
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cocacola[使用道具]
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请教各位,看了园里的帖子总结了下测蛋白浓度的目的基本上是为了保持上样量的一致,而且可以知道上样量的多少。但是有如下问题想请教下:
1:上样量一致得出的结果应该是直接比较的,但是测蛋白浓度后还是有很多的步骤的,比如煮沸就会改变蛋白浓度,还有放置时间问题,这样的话测出的结果是和总蛋白浓度比较比较可靠呢还是和内参比较比较可靠呢?有的说两个都可以,但是我做出来的结果并不是很一致又该怎么办呢?
2:我看到很多文献里包括国外的有关WB的实验中并没有测蛋白浓度这一项呢,是大家都默认不写还是什么原因,既然不写也可以是不是大家都默认和内参比较的结果比较可靠?

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虽然都没写蛋白浓度,但其实基本上都测过。但理论上测过并且上样量一样,也不保证结果完全一致,最可靠的做法,应该是在保证上样量一样的情况下(上样的总蛋白量),然后用目标蛋白与内参蛋白条带的灰度值比较作为变化情况来观察结果。
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虽然都没写蛋白浓度,但其实基本上都测过。但理论上测过并且上样量一样,也不保证结果完全一致,最可靠的做法,应该是在保证上样量一样的情况下(上样的总蛋白量),然后用目标蛋白与内参蛋白条带的灰度值比较作为变化情况来观察结果。
但是从数学计算结果来看的话,您这种方法和我故意让总上样量不一致然后直接和内参比较的结果是一样的,还计算了个同样总浓度内参表达量不同的,两种方法的结果也是一样的
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我也有同样的疑问啊,很多时候测蛋白浓度其实不那么准确,我们实验室用Bradford法测定,很不稳定,根本没办法定准,这种情况该怎么办呢,还是需要根据内参来调的,那是不是就可以不测了直接根据内参调呢
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wu11998866[使用道具]
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其实 内参是最为准确的,测定蛋白浓度只是为了尽量在测定时候保持内参的浓度一致性,其实不测蛋白浓度也可以,那就要你先做一次内参然后再根据内参的多少调整上样量
我们平时在测定的时候就会测蛋白浓度,因为测定以后再上样,还是比较准确的,内参不会差距太大
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niangao1980[使用道具]
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首先,测定蛋白浓度的目的是上样量一致,在我的实验中,上样量一般而言是用ug做单位,即质量单位。而不是浓度单位ug/ul,一般提蛋白的时候加入蛋白酶抑制剂,煮沸的时候蛋白变性,但是质量变化不大,体积和浓度可能因为水的蒸发改变。内参是蛋白浓度一致的证明,内参一致,代表蛋白上样量一致。

在国外的结果中,一般认为内参齐就是蛋白浓度齐。wb是半定量实验,并不是条带多少代表蛋白浓度多少。影响条带深浅的因素很多,比如压片时间等。所以大家默认的是内参齐,而一般不会在乎上样量是多少。
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niangao1980[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 am10 于 2013-5-31 10:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教各位,网站帖子总结了下测蛋白浓度的目的基本上是为了保持上样量的一致,而且可以知道上样量的多少。但是有如下问题想请教下:
1:上样量一致得出的结果应该是直接比较的,但是测蛋白浓度后还是有很多的步骤的,比如煮沸就会 ...

建议用ug做上样量单位,这样的结果比较齐,不要用浓度,这是我的经验。希望对你有帮助。
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