【求助】内有做GPCR类蛋白表达纯化的吗？

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标题:【求助】内有做GPCR类蛋白表达纯化的吗？

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

G蛋白偶联受体(GPCR)是一类七次跨膜受体，它们广泛地参与细胞增殖、分化、迁移，尤其是各类生理活动的调控。从近几十年药物发展的历史看，全球70%所开发的药物都是针对GPCR的，因此GPCR也是令人瞩目的药物治疗靶点。据统计GPCR类蛋白占动物细胞总蛋白的30%以上。
既然GPCR类蛋白这么重要，不知道国内做的多不多，大家进来讨论一下吧！

yychen[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我就是做GPCR相互作用的，觉得GPCR很难做，因为它的表达很困难，用于真核表达的质粒很难构建，同时感觉它的原核表达也很困难，因为它的疏水片段太多了。
你做过GPCR的表达纯化吗？
目前正打算做GPCR的原核表达，但估计表达不出来。

yychen[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外，不知道国内谁做GPCR较多，做的较好？

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

就是不知道目前国内哪儿做GPCR比较多的, nopain知不知道目前国内在这方面的研究现状,我也正打算做GPCR,以后可以相互交流一下.

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yychen 于 2013-5-31 10:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我就是做GPCR相互作用的，觉得GPCR很难做，因为它的表达很困难，用于真核表达的质粒很难构建，同时感觉它的原核表达也很困难，因为它的疏水片段太多了。
你做过GPCR的表达纯化吗？
目前正打算做GPCR的原核表达，但估计表达不出来。 ...

原核可以表达出来，就是个活性问题，因为对细胞产生毒性，所以很容易形成包涵体。

yychen[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #5 bgf5 的帖子

如果原核可以表达出来，是否可以用GST pull down验证GPCR的相互作用呢？可是我看文献上基本没有这么做的。基本上是用GPCR的C 端，即可溶的片段去做原核表达。你做过GPCR的原核表达吗，能复性吗？
另外，我们这里做GPCR的很少，基本上做的都是核受体，很少做膜受体的。

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目前做binding assay主要用同位素标记来做,pull down应该也可以,但是未见文献报道过,我也没有试过,原核表达基本都是inactive的,也有些人在做refolding,据说可以达到50-60%的复性.我做的是膜受体,目前正在摸索中,所以希望大家多交流一下.

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发表于 2013-5-31 10:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

裴钢好像就是做这个吧

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
阿尔茨海默病神经系统疾病
裴钢
个人简介：
裴钢研究员毕业于沈阳药科大学，1981年获学士学位、1984获硕士学位。1985在比利时Ghent国立大学UNIDO/WHO学习班进修药物科学。 1986年在瑞典卡罗林斯卡研究所临床药理系进行访问研究。1991年获美国北卡大学生物化学和生物物理学博士学位，其后在美国杜克大学进行博士后研究。 1995年应聘担任中科院和德国马普学会共同支持的青年科学家小组组长。1999年当选中国科学院院士。2000年5月起任中科院上海生命科学研究院院长。2007年起任同济大学校长。1995年以来，该细胞信号转导研究组在国际性学术刊物上发表研究论文100多篇。

研究方向：细胞信号转导

研究工作：
本组从事细胞信号转导机制及生理功能的研究。目前本组的工作主要在以下三个方面：一) 研究G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导的调控以及与其它信号转导通路间相互作用(cross-talk)。GPCR是细胞表面最大的受体家族，是细胞接受外来信息最重要的感受器和起始点。GPCR和细胞内部不同信号通路间精细的对话是细胞对外来信息产生协调反应的分子基础。本组研究的项目揭示了GPCR 与p53、NF-κB等多条信号通路间的对话及特征，极大丰富了对GPCR细胞信号转导机理、功能及作用的认识，为包括炎症、癌变、HIV病毒感染和阿片滥用等重要疾病的发病机理及诊治提供了重要线索和潜在靶点。二) 研究GPCR信号调节表观遗传修饰对基因转录及细胞功能的调节的机制。近年来我们的研究发现GPCR通过促进β-arrestin 1进核传递信号，这不仅揭示了β-arrestin 1在细胞核内调节表观遗传修饰的新功能，也揭示了受体信息由细胞膜到细胞核内传递和药物作用的一条崭新途径。我们还发现β-arrestin 1通过表观遗传调节作用促进那些具有自身免疫性的CD4+T细胞存活。揭示了生物体内调节CD4+ T细胞凋亡和自生免疫的新机制，并且提示β-arrestin 1蛋白有可能成为研发自身免疫治疗药物的新靶点。三) 研究GPCR信号转导的生理功能。我们研究发现β2-肾上腺素受体被激活后，增强γ-分泌酶的活性，进而能够增加导致阿尔茨海默症的β淀粉样蛋白的产生。这项发现揭示了阿尔茨海默症致病的新机制，并且提示β2-肾上腺素受体有可能成为研发阿尔茨海默症的治疗药物的新靶点。
本课题组将继续深入研究GPCR调节不同表观遗传修饰，以及表观遗传修饰网络的机制及GPCR调节表观遗传修饰在胚胎干细胞向神经细胞定向分化中的作用；研究GPCR信号转导在神经系统疾病及阿尔茨海默症发生，发展和防治中的作用；并以细胞信号转导为手段，探讨中草药有效成分及方剂作用的可能机制。
本研究组在Cell，Nature Medicine，Nature Immunology，Molecular Cell等国际性学术期刊上发表论文100多篇，并多次获得科研类奖项。“G蛋白偶联受体信号与其它细胞信号通路间的对话机制”获2006年上海市自然科学一等奖；2007年获得国家自然科学奖二等奖。“蛋白激酶在阿片类物质介导神经信号的转导和赖受依赖中的作用”获2002年国家自然科学二等奖。“阿片类药物耐受和成瘾的分子机制研究”获2001年(首届)中华医学科技奖一等奖。“阿片受体磷酸化及其对受体信号转导的调控机制”获2001年上海市科技进步一等奖。“孤啡肽受体及阿片受体的信号传导机理研究”获1998年度中华人民共和国教育部科学技术进步奖一等奖。我们完成的“发现β抑制因子-1是调节 CD4+T细胞存活和自身免疫性的关键因子”这一研究成果还被评为2007年度中国基础研究十大新闻之一。

tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-5-31 10:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们组也算是要做GPCR的吧。。好难啊。。真核细胞培养的话，光细胞培养就是个难题；如果需要用原核表达，估计需要增加MBP或者Trx等tag吧。。所附文献是关于大肠菌cell free表达以及原核表达的一些现状，但是不知道能不能成功。因为GPCR每个不同，表达体系不能完全照搬，而且去垢剂的筛选也是一项重要工作啊。。。。。。。。