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标题:【求助】酶切后，目的片段哪里去了？

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发表于 2013-5-31 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酶切后，目的片段哪里去了？

做了快俩月的酶切了，要崩溃了。泳道1是酶切前的GST融合蛋白，泳道2是酶切后的，只剩下GST了，我的目的蛋白哪里去了，应该在marker从下往上数第二和第三条带之间。不断的调整酶切条件，只偶尔能看到目的片段，而且量非常少，跟GST标签不成比例（根据大小比较）。有哪位指点一下。

注：融合蛋白放久了也发现降解的只剩下标签蛋白了，难道我碰上超级不稳定的蛋白了么。。。。。。


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发表于 2013-5-31 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

泳道1的蛋白范围很宽？
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发表于 2013-5-31 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 101010 于 2013-5-31 10:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

泳道1的蛋白范围很宽？

不纯而已，最浓的那一条带。上样量比较大的原因吧。
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 小中大

感觉你的目的蛋白在没酶切前已经存在降解现象。泳道1主带最下面位置有一条和泳道2的GST位置大小一致的蛋白，感觉这个就是目的蛋白降解后剩下的GST标签。
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 小中大

蛋白出现降解，可能是保存条件不好，或是存在蛋白酶污染导致的。

你纯化时，可以尝试加点蛋白酶抑制剂，如PMSF,EDTA等。
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发表于 2013-5-31 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 DONT 于 2013-5-31 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

蛋白出现降解，可能是保存条件不好，或是存在蛋白酶污染导致的。

你纯化时，可以尝试加点蛋白酶抑制剂，如PMSF,EDTA等。

酶切前是有降解，纯化的时候是加入PMSF的，因为只是做抗原用，就没有做到太纯，我怀疑是不是留下来的杂蛋白中有蛋白酶能降解这个蛋白。
但是有以前做的同一蛋白纯化到95%以上的样品，也同样存在上述现象。难道说我配的Buffer污染了？按道理来说一个融合蛋白不应该这么娇气的。
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发表于 2013-5-31 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能有两种原因：
1. 目的蛋白去除融合标签后溶解度低，沉淀了。因此电泳检测不到。
2. 蛋白被降解，即是污染了蛋白酶或者出现autolysis。

我觉得沉淀的可能性挺大。
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发表于 2013-5-31 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 lgm 于 2013-5-31 10:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可能有两种原因：
1. 目的蛋白去除融合标签后溶解度低，沉淀了。因此电泳检测不到。
2. 蛋白被降解，即是污染了蛋白酶或者出现autolysis。

我觉得沉淀的可能性挺大。 ...

谢谢你的意见！
沉淀我倒是没有考虑到，我该怎么样检测一下呢？是一个大概8KD的片段，等电点应该在5.5左右，我用ph 8.0的酶切buffer，不知道收不收回沉淀。

我怕的是蛋白不稳定，自身降解了。
蛋白酶污染的可能性应该比较小，一来实验室很久没有用过其他蛋白酶了，二来最近两次我也很小心操作。除非是菌体来源的蛋白酶。
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发表于 2013-5-31 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的结果跟我一样。我试过柱子上酶切，也试过酶切之后再过柱，结果都一样。我感觉我的那个有两个可能，要么就酶特异性不强，把目的蛋白切碎了，要么就是目的蛋白上有酶切位点。我之前看过别人说，pmsf会使酶切反应终止，不知道是不是真的，我最后是放弃了，目的蛋白重新连接其他的载体，表达的，楼主如果之后找出原因做出来了，能帮忙给我发个邮件，告诉我哪里出现问题了吗，我也学习借鉴下哈
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发表于 2013-5-31 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做了快俩月的酶切了，要崩溃了。泳道1是酶切前的GST融合蛋白，泳道2是酶切后的，只剩下GST ...

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我的情况同楼主几乎是一样的，我是在beads上直接酶切的，浓缩之后对剩下的beads也跑了电泳，很明显可以看到GST和我的目的蛋白，请教各位怎么能使目的蛋白溶解在上清中呢？加DTT可以吗？需要多大浓度呢？

第四条泳道哦！倒数第三条是我浓缩后的酶切之后的上清！麻烦各位帮忙看看哦！在线等！


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