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标题:【求助】蛋白超滤是变的发白发混，损失巨大

daod[使用道具]
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发表于 2013-6-1 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白超滤是变的发白发混，损失巨大

我现在在纯化一个蛋白，带His标签的，在用膜包超滤时，蛋白溶液变得发白发混，并且损失非常多，也没有办法用EK酶切，这是为很么啊？
请大家帮帮我！谢谢了
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-6-1 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有2个可能
1.浓缩后，蛋白浓度太高了，接近目的蛋白的溶解度峰值。
2.目的蛋白的缓冲体系不适合，目的蛋白沉淀。
建议：
1.调整缓冲液体系的PH或郭强度
2.向其中加入表面活性剂。
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-6-1 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

缓冲体系不适合，调整缓冲液体系
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S6044[使用道具]
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发表于 2013-6-1 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感觉是蛋白不稳定，高浓度下容易沉淀。建议加入10%的甘油，可以的话还可以加入0.1%～0.2%的Tween－20，可以起到保护蛋白的作用。
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8s5g[使用道具]
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发表于 2013-6-1 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在超滤过程中我没有进行浓缩，并且我也注意了避开等电点，我只是想通过超滤，将咪唑除去，并且将体系调整成EK酶切时的条件（20mMTris，50mMNaCl，2.5mMCaCl2）,而且在超滤前和超滤后用的都是Tris-HCl体系，只是浓度有所不同！
并且，我发现在超滤过程中如果不加入CaCl2，蛋白溶液就不会变白，可是损失依然很大，而且不加CaCl2我也没办法进行酶切！
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-6-1 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.我感觉你的蛋白应该和Ca2+有作用，你应该是想切掉标签吧
2.你的缓冲液PH值现在是什么样的，如果可以将其调到8.5左右试试
3.还你的缓冲液中，如果没有NaCl是否可以？是否可以稍增加CaCl2浓度？（1倍）
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发表于 2013-6-1 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果只是想去除某一成分，建议使用透析的办法。用超滤换液的过程中，无可避免会在短时间内提高蛋白的浓度，此外超滤过程中，蛋白也会吸附在超滤膜。
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daod[使用道具]
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发表于 2013-6-1 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白的PI是8.2，我用的体系是PH6.7的！
我也考虑了是不是吸附在超滤膜上了，可是之后用NaOH冲洗，跑了个电泳，也没有目的蛋白啊！
EK酶的厂家说加入CaCl2之后变白，有可能是跟磷酸根离子反应成沉淀了，可是我的体系里都没有磷酸根离子啊！只是在摇菌的时候加入了一点磷酸盐缓冲液，可是之后又是离心，换成Tris-HCl系统，而且还上过Ni柱，理论上是不可能还存在磷酸根离子啊！
还有，请问您说不加NaCl和增加CaCl2浓度分别有什么作用吗？
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发表于 2013-6-1 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想Ca可能会和你的EK酶活性有关，但Na可能不会影响到它。
降低NaCl浓度，是提高目的蛋白的溶解度（但与蛋白本身性质有关）
是否可以在样品中加入少量甘油等。
溶液的PH值可以向上提0.5一1个单位。
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u76mp[使用道具]
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发表于 2013-6-1 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白的PI是8.2，我用的体系是PH6.7的！
我也考虑了是不是吸附在超滤膜上了，可是之后用NaOH冲洗，跑了个电泳，也没有目的蛋白啊！
EK酶的厂家说加入CaCl2之后变白，有可能是跟磷酸根离子反应成沉淀了，可是我的体系里都没有磷酸根离子啊！只是在摇菌的时候加入了一点磷酸盐缓冲液，可是之后又是离心，换成Tris-HCl系统，而且还上过Ni柱，理论上是不可能还存在磷酸根离子啊！
还有，请问您说不加NaCl和增加CaCl2浓度分别有什么作用吗？

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你的蛋白多少KD，超滤的截留分子量是多少。会不会是目的蛋白已经透出去了，把超滤的废液也跑个电泳看看。
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