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标题:【求助】关于Westernblot蛋白质条带

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【求助】关于Westernblot蛋白质条带


看文献时经常发现:Westernblot蛋白质条带中除特异性带外,有时出现免疫球蛋白重连或轻连!请问这是怎么回事?
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avi317[使用道具]
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这其实就是克隆抗体的重、轻链可变区基因,然后分别将重、轻连可变区基因装入表达载体中,与人免疫球蛋白恒定区CHI和Cκ基因融合。此载体在其嵌合重链和轻链前均有一段信号肽,可引导轻、重链分泌到质周腔,折叠形成功能片段。然后用Westernblot确定大致的表达量。
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谢谢!但这些文献并没有克隆抗体的重、轻链可变区基因!我想不应该是这个原因!
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全文链接:
cuturl('http://mcb.asm.org/cgi/content/full/23/24/9262?view=full&pmid=14645536')
谢谢!
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qqq111[使用道具]
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SORRY,看的不是很清楚(哎,眼睛花了……)。但我看你的绿线划提示的是共沉淀后进行的WB。因此,它的结果必然和一般的WB会有差别。此处是否为开始时引入的抗体,尚待进一步的明确。
不过,我看了半天,似乎没有讲到免疫球蛋白重连或轻连的克隆。
另外,很可惜的是上面的全文还是看不到,因此没有整体的把握,说的可能没有充分依据。至于详细的免疫共沉淀方法,我提供一篇参考文献
Nossal G J V. Negative selection of lymphocytes. Cell, 1994, 76: 229~239
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这是把Flag-tagged dTGIFa和Myc-tagged mSin3 在细胞中共表达后,分别用anti-Flag和anti-Myc做了IP,再用anti-Flag和anti-Myc分别做WB检测IP产物。由于IP产物中本身就包含IgG(anti-Flag和anti-Myc),所以在后面的WB中,IgG的轻、重链会和二抗发生免疫反应,从而在WB结果中出现有轻、重链的条带。

良哥现在毕业论文准备得怎样了?祝一切顺利
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这是否由于Flag-tagged dTGIFa分子量与轻、重链相差大,而T7-tagged CtBP的分子量与重链接近,所以出现用FLag作IP后,用Myc抗体做WB未显示轻、重链的条带(在其它区域应有轻、重链的条带);但用T7抗体做WB却出现重链的条带(在其它区域应有轻链的条带)。
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是的,文中其它WB的片子(或膜)上可能也有IgG轻(27KDa)、重链(54KDa?)条带,只是由于和目的蛋白分子量差得较远,所以才在裁下来的图中看不到——IP经常会有非特异条带,为了直观,发表的文章常把WB结果中特异条带的信号裁下来。
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Should be like this:

1. In regular WB, usually you can not see IgG-H, or -L. Because the commercial conjugated-2nd ABs are optimized to avoid cross-reactions. But not absolutely, so be careful when you choose conjugated-2n-AB.

2. If IP, or Co-IP is applied. The thing becomes different. The L- or H-chain will appear, even MUST appear to prove your experiment works fine. Because: a) the 2n-AB recoginze the AB used in IP, or Co-IP; b) the 2n-AB re-nature with the AB used in IP, or Co-IP; and c) the 2n-AB cross-react with the AB used in IP, or Co-IP
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