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标题:【求助】镍柱再生时SDS析出堵了

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-6-1 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】镍柱再生时SDS析出堵了


如题，在参考了好几家公司说明书后进行镍层析柱再生，其中有一步用到2%SDS。我手上有2个柱子，一个流速正常，一个流速较慢，同时放在4℃环境下操作，流速较慢的柱子在通过2%SDS时SDS析出堵在柱子里，而时流速正常的柱子没问题。目前流速正常的柱子已经完成重生步骤，而被SDS堵住的柱子，我用去离子水过柱，但堵得太厉害流不过去，放了一夜都不行，请教各位有什么办法可以解决这个问题。
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发表于 2013-6-1 12:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

取出用碱处理，就应该能溶解。或直接过0.1M NaOH试试,通常再生并不用SDS.
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 小中大


QUOTE:
原帖由 00无名指00 于 2013-6-1 12:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

取出用碱处理，就应该能溶解。或直接过0.1M NaOH试试,通常再生并不用SDS.

多谢，我试试看。我是看好几个公司说明书上写在盐酸胍之后用SDS，再用乙醇，我想了下可能是出于用SDS变性蛋白从而与柱子脱离的原因，所以照做了。
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发表于 2013-6-1 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 89tongzijun 于 2013-6-1 12:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


多谢，我试试看。我是看好几个公司说明书上写在盐酸胍之后用SDS，再用乙醇，我想了下可能是出于用SDS变性蛋白从而与柱子脱离的原因，所以照做了。 ...

是因为盐酸胍处理之后没有用大量的水洗，所以遇到SDS会沉淀。以前我也遇到过。
当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色，此时Ni-NTA树脂需要再生后才能使用。
所需试剂：
再生缓冲液：6M盐酸胍＋0.2M乙酸
2％SDS（m/V）
25％，30％，50％，75％的乙醇（V/V）
100mM EDTA,pH8.0
100mM NiSO4
裂解缓冲液A：
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +6M盐酸胍, pH8.0
裂解缓冲液B：
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素，pH8.0
步骤如下：
1.  用下列试剂依次彻底冲洗层析柱：
2倍柱体积的再生缓冲液
5倍柱体积的双蒸水
3倍柱体积的2％SDS
1倍柱体积的25％的乙醇
1倍柱体积的50％的乙醇
1倍柱体积的75％的乙醇
5倍柱体积的100％的乙醇
1倍柱体积的75％的乙醇
1倍柱体积的50％的乙醇
1倍柱体积的25％的乙醇
1倍柱体积的双蒸水
5倍柱体积的100mM EDTA
1倍柱体积的双蒸水
2倍柱体积的100mM NiSO4
2倍柱体积的双蒸水
2倍柱体积的再生缓冲液
2.  2倍柱体积的适当的裂解缓冲液（A或B）平衡Ni-NTA树脂
3.  将再生后的Ni-NTA树脂按1：1的比例保存在30％的乙醇中

处理方法：
用玻璃棒搅动，使形成的沉淀物流出即可。下面的管子加长，才会流出来。
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发表于 2013-6-1 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS在低温下也会沉淀，在室温处理就可以了
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发表于 2013-6-1 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
SDS在低温下也会沉淀，在室温处理就可以了

===========================================================================================================

恩，后来我意识到这一点，在室温下操作，SDS还是不溶，另外谢谢你上面介绍的protocol，我用的和你基本一样。感谢chromatography告诉我用0.1M NaOH处理后通畅了，但是我发现之后在过EDTA后变淡褐色不如另外一个柱子明显，似乎仍有少许蓝色存在，我怀疑会不会是仍有残留沉淀蛋白之类的结合镍柱上，使这部分镍离子未能排除，虽然现在已经加过硫酸镍重生完毕，但是考虑如果我怀疑的确实存在的话会影响柱子的结合效率，正在考虑要不要再过一次盐酸胍。
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发表于 2013-6-1 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
取出用碱处理，就应该能溶解。或直接过0.1M NaOH试试,通常再生并不用SDS.

===================================

你一般镍柱重生的话，都用哪些试剂，谢谢。
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 小中大

可直接用6M盐酸胍加加500mM咪唑洗5-6个柱体积,如果要彻底再生可先用EDTA洗去镍离子再彻底再生,通常也就是盐酸胍或NaOH,如果是脂溶性物质可选择100%乙醇或异丙醇.
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 小中大
可直接用6M盐酸胍加加500mM咪唑洗5-6个柱体积,如果要彻底再生可先用EDTA洗去镍离子再彻底再生,通常也就是盐酸胍或NaOH,如果是脂溶性物质可选择100%乙醇或异丙醇.

===========================================================================================================

谢谢指教，还想问下，盐酸胍和咪唑混合后一起过柱可行吗？另外就是我之前问过的疑问，就是会不会有什么因素影响EDTA对镍离子的清除，因为我觉得有个柱子过EDTA后变浅褐色不如另外一个明显。
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发表于 2013-6-1 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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恩，后来我意识到这一点，在室温下操作，SDS还是不溶，另外谢谢你上面介绍的protocol，我用的和你基本一样。感谢chromatography告诉我用0.1M NaOH处理后通畅了，但是我发现之后在过EDTA后变淡褐色不如另外一个柱子明显，似乎仍有少许蓝色存在，我怀疑会不会是仍有残留沉淀蛋白之类的结合镍柱上，使这部分镍离子未能排除，虽然现在已经加过硫酸镍重生完毕，但是考虑如果我怀疑的确实存在的话会影响柱子的结合效率，正在考虑要不要再过一次盐酸胍。

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楼主你好，我现在也遇到了和你一样的问题，也是过SDS的时候把柱子堵上了，我用0.1M NaOH处理10分钟，但是柱子还是不通，是为什么呀？是不是处理的时间不够呀？不知楼主之前是怎么解决的，能具体说明一下吗？谢谢！！
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