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标题:【讨论帖】蛋白表达自动诱导系统以及大幅度提高产量

mingming0638[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】蛋白表达自动诱导系统以及大幅度提高产量

最近2个月一直在研究studier的auto-induction Protein Expression System.
他今天三月份在Protein expression and purification上发表了一篇长达28页的文章“Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures。 Protein Expression and Purification 41 (2005) 207–234” 综述了3年来冷泉港一直在用的他发明的方法。看了之后感觉studier这个人太牛了，pet系统就是他发明的。但为了解决表达型质粒的自发诱导的问题（就是不加诱导剂，菌液摇到饱和时总有目的蛋白自动表达的问题，这也是有毒蛋白不能表达的原因），他彻底研究了培养基的每一种组分，最后发现是胰蛋白胨里的少量的乳糖在作怪，他同时又发现了葡萄糖，和氨基酸能抑止乳糖的诱导，在培养基的研究中，他发明了全新的培养基组分，在这种培养基里，菌液的OD值很简单的就能达到5－50左右，在此基础上，他发明了自动诱导系统，就是在培养基里含有少量葡萄糖（0.02%),和0.2%的乳糖，当然还有其他营养组分。当菌液摇到饱和时，这时葡萄糖已经被消耗光，就开始利用乳糖，而乳糖的中间代谢产物异乳糖就相当于IPTG，就自发的开始了诱导，由于菌液相当的浓，蛋白产量普遍能提高几倍到几十倍，我用这套将我的一个蛋白从10毫克每升产量一下子提高到了150毫克每升。我的菌液一般饱和在OD值8左右，这比studier说得要低一些，因为我没用他说的baffled flask来培养，这种培养瓶就是底部像可乐瓶底那样，供氧量能极大提高。
他的配方还彻底解决了有毒蛋白，质粒不稳定等一系列问题。以前的质粒不稳定和蛋白有毒导致无法划线，主要是因为即使在没有诱导剂的情况下，菌仍然会表达少量的外源蛋白，一旦质粒表达外源蛋白，菌就倾向于排斥这个质粒，如果蛋白有毒，菌甚至会无法生长。但是新的培养基中，质粒不会表达外源蛋白，质粒在表达菌中就跟在克隆菌中一样，大家共同繁荣，相当稳定。菌液（即使带有超毒性的质粒）可以4度冰箱存放好几个星期。还有人提出表达的时候甚至不用加抗生素，因为抗生素一个作用是抑止杂菌，但是其更大的作用在于能维持质粒的拷贝数，菌需要质粒才能活啊。但是当质粒在菌体中安全无害的时候，没有抗生素，质粒也能维持一定的拷贝数。我还有个有毒蛋白的问题，也因此彻底解决了。感觉太好了，这套系统我相信在不久将来会全面普及，事实上我刚开始研究这套系统时，网上还没什么资源，但是仅仅过了一个多月，就发现已经有很多结构研究的实验室采用这套系统了。这套系统尤其适用于高通量筛选。因为做高通量的人可能知道，构建好了一批质粒后，想同时做表达测试老出问题，就是含有不同质粒的菌很少同步地摇起来。用studier的系统能有效解决这个问题。我相信中国搞结构的实验室很快会普及这个方法。这里我把我用的一些资源整理给大家，有问题可以共同讨论一下，里面有我在组里的一个报告，是在studier的ppt基础上修改的，还有studier的原始论文，和他给出的详细配方
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发表于 2013-6-1 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在做gst融合蛋白的纯化也可以用这个系统吗?我的蛋白是在大肠杆菌中表达,担诱导的不明显,用IPTG诱导,我需要的量也很大,另外第二篇就只有18页吗?我怕下载的不全,谢谢!!!!现在正着急呢!!
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

只要是T7表达系统都可以，studier最后还提到了对于其他具有不同诱导机制的表达系统也可以发展自动诱导系统。18页的文章是给的培养基配方，是对的
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发表于 2013-6-1 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
MDG培养基中的0.2×metals是怎么配的?这个培养基可以和LB一样高压灭菌吗?(文章中说15min)做一个蛋白表达两个多月了一直无果,我也怀疑质粒不稳定的问题,你可以把你的protocol贴上来供参考吗?谢谢!
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于0.2×metals,你需要配成1000×的储存液，我配的溶液中不含亚硒酸钠，因为这个东西很难买到，它是剧毒的。其他的金属溶液，每种金属都要先配成单独的储存溶液：
1 M CaCl2
1 M MnCl2
1 M ZnSO4
0.2 M CoCl2
0.1 M CuCl2
0.2 M NiCl2
0.1 M Na2MoO4
0.1 M H3BO3
以上高温灭菌，（不用配很多，每个配10到20ml就够了），室温保存
还有：
0.1 M FeCl3 in ~0.12 M HCl
就是用大约稀释100倍的浓盐酸配的 FeCl3 溶液，不用灭菌，室温保存
最后按照studier给的配方，将这些溶液混合起来，大约100ml，即成了1000×metals，室温保存即可使用。我最后一步还将混合液用0.2um滤膜过滤了一下，不过好像没必要
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发表于 2013-6-1 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有人向我询问具体的实验步骤，这个要写出来很长，不过我这有国外一个实验室使用的protocol，里面有很详细的实验步骤。看这个protocol的时候要注意，这个protocol是studier给他的一个早期版本，在培养基的采用上与现在studier的实验室使用的有所区别，但结果没什么区别，大家可以随意采纳，我现在用的studier实验室普遍采用的配方，即用的是MDAG（protocol里是用zyp-0.8G)，做小摇菌种和保存菌种用（注意studier用的MDG，但我发现这个很难摇起来，可能跟供氧有关），用ZYM-5052（protocol里是用ZYP-5052)表达蛋白用，对于一般的质粒用LB＋1％glucose的平板划线，对于毒性质粒用MDAG做的平板转化，.
还有protocol里是晚上1：1000接到大瓶里摇，早上收菌就可以提蛋白。我的一般是摇20个小时左右，因为我没用baffled flask，菌长得慢些，你一定要保证里面的葡萄糖被消耗光，蛋白才会表达。通常第一次做的时候，可以摇长些，不同时间段测OD值，取样看看蛋白表达情况，以后就心中有数了。
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发表于 2013-6-1 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
准备用MDG培养基试试了,是不是和通常的LB培养基一样,头天晚上接种单克隆,第二天转接到另一管MDG中,待生长到对数生长期加诱导剂呢?我不想用auto-inducing media ZYM-5052,因为我不需要太大的产量.
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 小中大

MDG培养基我接单克隆的时候很难摇起来，问题可能出在供氧上面，你可以试试，要是能摇起来，请你我告诉一下。studier说这个培养基比LB培养要慢几个小时，但是我的需要24小时甚至更多时间才能摇起来，所以我一般用MDAG的培养基，里面加了18种aa，MDG应该可以来蛋白表达，你可以到摇到饱和的时候加诱导剂，不用在对数生长期加
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发表于 2013-6-1 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼主,还有个问题想请教,Studier的这个自动诱导系统确实能解决渗漏表达、重组质粒不稳定的问题,而且产量很大,但protocol上说通常都形成了包含体,是这样吗?毕竟如果形成包含体复性起来还是很麻烦的,您用这个系统表达的蛋白是包含体还是可溶性表达呢?还有,BL21(DE3)plysS菌也能降低基础表达,您有没有用这个菌表达的经验呢?不知道为什么这个菌长的很慢,挑单克隆摇一夜只是轻微混浊.
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 小中大

包含体的形成与否与普通IPTG诱导的结果相当，我经验看来，可溶性的效果上可能还好些，因为乳糖的诱导不同于IPTG，它要经过好几个过程，同时它又是碳源之一，所以它的诱导是很温和的一个过程，而IPTG是很剧烈的一个过程，浓度高的时候，蛋白的折叠速度就会跟不上表达速度，导致包含体的形成。我在IPTG诱导时的两个可溶性蛋白，在5052系统中也是完全可溶的。我一直用的Rosetta(DE3)plys，你应该知道吧，带有稀有密码子的。这种plysS菌确实有点慢，我在MDG里摇的很慢，可能就跟菌有关系。
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