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标题:【求助】蛋白质转导

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【求助】蛋白质转导

相关疾病:
神经系统疾病脑缺血
PTD介导的蛋白质转导技术及其在神经系统
疾病治疗中的应用

生理状态下,真核生物细胞膜仅对少量小分子具有通透性,大大限制了生物大分子药物对疾病的治疗。由于转基因技术可操作性差、转运效率低、具有潜在的生物毒性作用、并且并非所有细胞均能被转染等缺点,限制了其实际应用[1]。PTD介导的蛋白质转导技术则使大分子蛋白质或多肽自由通透细胞膜成为可能,随之产生疾病蛋白质治疗技术。本文就这一技术及其在神经系统疾病治疗中的意义作一综述。
1.蛋白质转导域(protein transduction domain,PTD):
又称为细胞穿膜多肽(cell-penetrating peptides, CPP),是一类能够介导与之相连的多肽或者全长蛋白质穿过生物膜进入细胞的多肽结构,最初是发现于HIV病毒转录因子Tat蛋白中。目前已发现多种含有PTD的蛋白质,主要有以下几种:
1)HIV病毒Tat蛋白:是病毒复制后期所必需的转录调控因子,全长86个氨基酸。Mann 和Schwarze等确定具有蛋白转导功能的最小肽段是47-57氨基酸(YGRKKRRQRRR) [2]。
2)单纯疱疹病毒(HSV)VP22蛋白:是成熟病毒蛋白衣壳与包膜之间的间层蛋白的主要成分,全长301氨基酸。目前认为具有蛋白转运功能的是C端34个氨基酸(DAATATRGRS AASRPTERPRAPARSASRPRRPVE),但目前通常仍以VP22全长cDNA与外源基因连接后以病毒载体等方式转染靶细胞[3]。
3)果蝇触角蛋白同源结构域(AntpHD):果蝇体内存在一族称为“同源蛋白(homeoproteins)”的转录因子,AntpHD是其中典型的一种,包括三个强碱性的螺旋结构,对蛋白质起转导作用的是由16个氨基酸组成的第三个螺旋结构(RQIKIWFQNRR MKWKK)[4]。
4)人工设计的PTD:Mitchell等合成9个L-精氨酸(R9)或9个D-精氨酸(r9)组成的多肽,分别比Tat-PTD的蛋白转导效率高20倍或100倍[5];May等设计并合成21个氨基酸的多肽(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV),与30kD的GFP, 110kDβ-Gal及全长特异性抗体交连后表现出很高效率的蛋白转导作用并保持生物活性[6];
5)其他PTD蛋白:流感病毒血凝素及乳铁转运蛋白,成纤维细胞生长因子1、2及最近发现的谷胱苷肽转移酶(GST)[7]等均具有相似的功能,但研究较少。
2.PTD转导蛋白的特点
1)转导效率高:PTD可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内转导进入细胞,目前已将>100kD的蛋白质如β半乳糖苷酶转导进入小鼠体内并保持了生物活性[8]。
2)能量、受体非依赖性:Vives、Derossi等研究发现,用代谢酶抑制剂叠氮钠,鱼藤酮或冈田酸等阻断细胞能量代谢后,并不影响Tat或AntpHD介导的蛋白质转导作用;在4℃下仍然可以进行且转导效率没有显得降低;应用细胞内吞抑制剂对Tat蛋白质转导也没有明显影响[9,10]。Futaki等用D-氨基酸全部替换Tat-PTD后转导效率不改变,说明蛋白质转导也不是受体介导的[11]。
3)可以通透血脑屏障(blood brain barrier, BB:与PTD融合表达的蛋白不仅可以穿膜进入体外培养的细胞,而且可以通过血液循环运输至脑组织,跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内,为大分子蛋白治疗中枢神经系统疾病提供了可能[8]。
4)应用广泛: PTD不仅可以介导多肽或者全长蛋白质进入细胞,而且可以介导各种巨型分子如寡核苷酸链[12],直径大于50nm的磁珠[13],连接放射性物质的树脂分子[14],甚至是200nm的脂质体[15]等,均可被PTD转导进入细胞。
3.PTD介导蛋白转导的机制
1) PTDs的氨基酸组成分析:生理状态下,碱性氨基酸有精氨酸(Arginine,R)和赖氨酸(Lysine,K),带正电荷;酸性氨基酸有天冬氨酸(Aspartate,D)和谷氨酸(Glutamate,E),带有负电荷。在真核生物编码的蛋白质中,碱性、酸性氨基酸出现的几率是分别是0.1和0.11;分析PTDs的氨基酸序列发现,K和R出现的几率比预期几率高3-7倍,D和E则几乎不出现。PTDs等电点(PI)均>9,生理状态下带有正电荷[16]。
表1 转导区的氨基酸组成分析(Leifert et al, 2003)
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Sequence  Basic  Acidic  PI
    Obs  Exp  Obs  Exp  
HIV tat  YGRKKRRQRRR  8  1.1  0  1.2  12.7
VP22  DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE  9  3.4  3  3.7  12.9
Antp HD  RQIKIWFQNRRMKWKK  7  1.6  0  1.8  12.7
2) 细胞膜表面的负电荷物质:Mann和Frankel等最初发现,用肝素(heparin),硫酸右旋糖苷(dextran sulfate)孵育细胞后,Tat蛋白的穿膜入胞作用受到抑制[17]。Rusnati等进一步发现,细胞膜表面的类肝素物质硫酸乙酰肝素多聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HS)是HIV Tat蛋白进入细胞所必需的成分[18]。Tyagi等应用糖胺聚糖水解酶(glycosaminoglycan lyases )裂解包膜表面的HS以后,Tat蛋白转导作用被抑制;生物合成HS缺陷的细胞,Tat的穿膜转导作用也停止[19]。因为HS广泛存在于细胞膜表面,故PTD可以将与之相连的蛋白质或多肽片段高效的转导进入各种组织细胞中。
3)精氨酸与色氨酸在PTD蛋白转导中的作用: PTD介导的蛋白质转导依赖于精氨酸的数量及其在肽段中的位置。Wender等用丙氨酸(Alamine)代替Tat(47-57)非带电的谷氨酰胺(Glutamine)不会影响蛋白质的转导,而代替任何一个碱性氨基酸后,转导能力减低70-90%。长度为8-9个精氨酸得多肽具有最高的转导效率,随着精氨酸数目增加逐渐失去转导作用。而D构型的精氨酸转导效率更高。精氨酸中的胍基起重要作用;Wender等以甘氨酸为碳架合成的一系列侧链带有胍基的多聚精氨酸类似物(N-alkyl-Glcine)也具有蛋白质转导功能,而多聚瓜氨酸(精氨酸胍基中的N被O代替)没有转到活性。可能是因为胍基中的亚氨基NH可以提供H原子,和细胞膜上的磷脂或者硫酸基形成稳定的氢键。赖氨酸或者组氨酸则不可以。加入脯氨酸破坏PTD螺旋结构后转导能力并不下降,说明与螺旋结构并无关系[20]。在研究AntpHD穿膜作用时发现,其中的色氨酸(Tryptophan, W6) 突变后AntpHD穿膜转导功能下降;AntpHD的突变体(W6F)可以介导寡核苷酸链结合于细胞膜表面,但穿膜进入胞浆的效率大大降低; Christiaens进一步发现在蛋白转导过程中,AntpHD中W6残基深深插入脂双层中,提示色氨酸的作用可能是与膜磷脂的脂肪链相互作用而造成脂膜的不稳定,促进质膜囊泡(micelles)的形成。同时也间接说明,AntpHD 与胞膜是通过静电相互作用的,而不是通过受体介导的[21]。
4)PTD介导蛋白质转导机制
Berlose等在用核磁共振技术发现AntpHD介导的蛋白转导时有磷脂囊泡的出现[22]。结合后期的研究工作,Alain Prochiantz提出蛋白质转导“囊泡(inverted micelles)”模型的假设[23],认为细胞摄取Antp至少需要相转移(Phase transfer)和穿膜转导(translocation)2个步骤,后者依赖于色氨酸的存在。首先,带有正电荷的PTD与细胞膜表面带有负电的HS等多聚糖分子以静电的方式相结合(转移至疏水相),随后,在色氨酸的作用下生物膜失稳定(destabilization),胞膜内陷形成脂双层结构的小囊泡;Antp或者被包裹在囊泡中进而向胞内释放,或者直接穿过囊泡旁边破坏的膜脂而进入细胞 [24]。但其他PTD蛋白转导的机理是否相同尚不清楚。
4.蛋白质转导在神经系统疾病治疗中的重要意义
自从PTD被识别并鉴定以来,数十种蛋白质已被成功转导进入不同的细胞中,并被表现其相应的生物活性,还有部分蛋白被转导进入动物体内。随着这一技术的日益成熟,将越来越广泛的应用到疾病治疗方法的研究以及未知蛋白功能的研究中。
蛋白质转导技术也逐渐被应用到神经系统疾病治疗的研究中。生理状况下,由于血脑屏障(BB的存在,阻碍了有治疗意义的大分子物质如抗生素、抗癌药、多肽及功能蛋白质的进入脑组织。长期以来人们不断探索增加BBB通透性的方法。蛋白质转导技术的应用,为解决这一问题提供了崭新的方法。Sattler等应用PTD与编码PSD 95蛋白的第1、2 PDZ区的融合蛋白及***A受体NR2B(9C)的融合多肽,通过静脉注入小鼠体内后,成功地干扰了***A与PSD95的结合,下游nNOS的激活被抑制,从而阻断神经元损伤通路[25];Asoh等则应用同样的技术证明了人工构建的Bcl-xL突变体PTD-FNK具有更好的调亡抑制作用及脑缺血保护作用[26]。Cao 等也利用这一技术将Tat-Bcl-xL转入小鼠脑缺血模型的脑组织神经元内,并证明具有明显的脑保护作用[27];胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)与TAT在大肠杆菌中融合表达并转导入脑组织后,也显示良好的局灶性缺血脑保护作用[28]。总之,利用PTD介导的蛋白质转导技术,可以方便而高效地使外源性蛋白质通过外周血、腹腔等途径,跨越血脑屏障进入脊髓、脑组织细胞,为神经系统疾病的治疗提供新的研究思路。
综上所述,PTD介导的蛋白质治疗是一种极其方便而且高效的蛋白质转导方法。随着机理的阐明与方法的改进,相信在不远的将来会得到广泛应用。
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参 考 文 献
1 Green I, Christison R, Voyce CJ, et al. Protein transduction domain: are they delivering [J]? Trend Pharm Sci, 2003, 24(5): 213-215
2 Green M, Loewenstein PM. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein [J]. Cell, 1988, 55: 1779-1188
3 Elliott G, O. Intercelluar trafficking and protein delivery by a herpes virus structural protein.1997 [J], Cell, 88:223-233
4 Derossi D, Chassaing G, Prochiantz A. Trojan peptides:The penetratin system for intracellular delivery. Trends Cell Biol.1998, 8: 84-87
5 Mitchell DJ, Kim DT, Steinman L, et al. Polyarginine enters cells more efficiently than other polycationic homopolymers [J]. J Peptide Res., 2000,56, 318-325
6 Morris MC, Depollier J, Mery J, et al. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells [J]. Nat Biotechnol, 2001, 19, 1173-1176
7 Namiki S, Tomida T, Tanabe M, et al. Intracellular delivery of glutathione S-trans ferase into mammalian cells [J]. Biochem Biophys Res Commun.2003, 305(3):592-7.
8 Schwarze SR, Ho A, Vocero-Akbani A,et al. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse [J]. Science,,1999 , 285(5433): 1569-72.
9 Vives E, Brodin P, Levleu B, et al. A truncated HIV-1 tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus [J]. J Bio Chem, 1997, 272: 16010-16017
10 Derossi D,Calvet S, Trembler A, et al. Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor independent [J]. J Biol Chem, 1996, 271: 18188- 18193.
11 Futaki S, Suzuki T, Ohashi W, et al. Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery [J]. J Biol Chem, 2001,276: 5836-5840
12 Asteriab-Fisher A, Serguddv DS, Fisher M, et al. Antisense inhibition of P-glyco protein expression rising peptide oligonucleotide confugates [J]. Biochem Pharmacol, 2000, 60: 83-90
13 Underbaldinger P, Josephson L, Weissleder R. Tat peptide directs enhanced clearance and hepatic permeability of magnetic nanoparticles [J].Bioconjug Chem, 2002 13(2): 264-8.
14 Polyakov V, Sharma V, Dahlheimer JL, et al. Novel Tat-peptide chelates for direct transduction of technetium-99m and rhenium into human cells for imaging and radiotherapy [J]. Bioconjug Chem, 2000, 11: 762-71
15 Torchilin VP, Rammohan R, Weissig V, et al. TAT peptide on the surface of liposomes affords their efficient intracellular delivery even at low temperature and in the presence of metabolic inhibitors [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98 (15): 8786-91.
16 Leifert JA, Lindsay Whitton J. “Translocatory protein” and “protein transduction domain”: a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Mol. Therapy, 2003, 8(1): 13
17 Tyagi M, Rusnati M, Presta M, et al. Internalization of HIV-1 tat requires cell surface heparan sulfate proteoglycans [J]. J Biol Chem, 2001, 276(5):3254-61
18 Rusnati M, Tulipano G, Spillmann D, et al. Multiple interactions of HIV-I Tat protein with size-defined heparin oligosaccharides [J]. J Biol Chem. 1999, 274(40): 28198-205
19 Tyagi M, Rusnati M, Presta M, et al. Internalization of HIV-1 tat requires cell surface heparan sulfate proteoglycans.J Biol Chem, 2001, 276(5):3254-61.
20 Wender PA, Mitchell DJ, Pattabiraman K.The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(24):13003-8.
21 Christiaens B, Symoens S, Vanderheyden S, et al. Tryptophan fluorescence study of the interaction of penetratin peptides with model membranes [J]. Eur. J. Biochem, 2002, 269, 1-9.
22 Berlose JP, Convert O, Derossi D, et al. Conformational and associative behaviours of the third helix of antennapedia homeodomain in membrane-mimetic environments (NMR) [J]. Eur J Biochem, 1996, 242(2):372-86.
23 Prochiantz A. Messenger proteins: homeoproteins, TAT and Others [J]. Current Opi Cell Bio, 2000,12:400-406
24 Dom G, Shaw-Jackson C, Matis C, et al. Cellular uptake of Antennapedia Pene -tratin peptidesis a two-step process in which phase transfer precedes a tryptophan- dependent translocation [J]. Nucleic Acids Research, 2003, 31(2): 556-561
25 Sattler R, Xiong Z, Lu WY, et al. Specific coupling of ***A receptor activation to nitric oxide neurotoxicity by PSD-95 protein [J]. Science, 1999, 28411: 1845
26 Asoh S, Ohsawa I, Mori T, et al. Protection against ischemic brain injury by protein therapeutics [J]. PNAS, 2002, 99(26): 17107-17112
27 Cao GD, Pei W, Ge HL, et al. In vivo delivery of a bcl-xl fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against ischemic brain injury and neuronal apoptosis [J]. J of Neuroscience, 2002, 22: 5423
28 Kilic U, Kilic E, Dietz GP, et al. Intravenous TAT-GDNF is protective after focal cerebral ischemia in mice [J]. Stroke, 2003, 34(5):1304-10.
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我的课题就是用这种技术的。我写好这篇综述后给老板看老板说涉及临床的东西太少,不赞成我发表。所以搁置。那天有空,就贴上去与各位共享,想不到惹来这么多的麻烦!特此解释。
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原帖由 milkdog 于 2013-6-1 13:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的课题就是用这种技术的。我写好这篇综述后给老板看老板说涉及临床的东西太少,不赞成我发表。所以搁置。那天有空,就贴上去与各位共享,想不到惹来这么多的麻烦!特此解释。 ...

你好,我不知道你使用的表达载体是什么?自己构建的还是国外的朋友送给你的,使用的是pTAT-HA表达载体吗?假若是的话,不知是你是否有该载体更详细的资料?
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紧急求助有关pTAT表达载体更详细的资料?
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紧急求助,TAT-HA 载体的相关资料和蛋白表达纯化转导的protocol,
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I am very sorry to reply you so late just because I have not come here for a long time.
I used the pTransVector from qBiogene (cuturl('http://www.qbiogene.com/')).
The protocol of protein expression and purification can be found in the webside. The PTD is Antp HD so Drosophilae.
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