【讨论帖】个人的详细实验过程关于蛋白可溶表达与纯化

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标题:【讨论帖】个人的详细实验过程关于蛋白可溶表达与纯化

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发表于 2013-6-1 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是新手，但是做蛋白也2个月了，简单的说，从不懂到稍微懂，走了些弯路，鄙视那些不教人只说风凉话的，对于新人只有先获而后给，不叫不劳而获，不劳而获是连论坛都不上等着别人给你材料。
这次发下我这两个月的成果，给新人参考，也算是还丁香园给我的帮助（可以说，我学的都是论坛上朋友帮助的，现在还给论坛，也算是我自己的归纳了），我想我的文章新人肯定会有用。因为我以前想找类似的文章，可是没找到..

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发表于 2013-6-1 13:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一、证明目的蛋白有表达
1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1 mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图1
1: pET-32aA3未诱导，2: pET-32aA3未诱导，3: pET-32aA3诱导后，4: pET-32aA3诱导后

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2013-6-1 13:24

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发表于 2013-6-1 13:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

二、表达的情况，是可溶还是沉淀
1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9% NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9% NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9% NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH 7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下
功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）
4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图2
1: pET-32aA3诱导上清，2: pET-32aA3诱导沉淀

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发表于 2013-6-1 13:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

三、探索可溶表达条件
有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
影响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG浓度，摇床转速等等，所以设定在低IPTG浓度下（0.1 mmol/L），在不同温度，诱导时间下的表达对照：

1）37℃ 250rpm 5h
2）30℃ 180rpm 10h
3）23℃ 90rpm 30h
过程：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的50mL+50mL+60mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。从60mL培养液中取10mL作为未诱导对照，标记3个50mL LB培养菌液：1、37℃ 250rpm 5h 2、30℃ 180rpm 10h 3、23℃ 90rpm 30h
都分5次取样：
37℃ 每一小时取样一次（取10mL）编号为：371、372、373、374、375
30℃ 每二小时取样一次（取10mL）编号为：301、302、303、304、305
37℃ 每五小时取样一次（取10mL）编号为：231、232、233、234、235
诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE检测：
1、37℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀
2、30℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀
3、23℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀
4、以不同温度下的最优可溶表达做比较
结果如下：
图3图3：37℃条件下五个样的上清和沉淀

1: 371上清，2: 371沉淀，3: 372上清，4: 372沉淀，5: 373上清，6: 373沉淀，
7: 374上清，8: 374沉淀，9: 375上清，10: 375沉淀

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2013-6-1 13:25

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小中大

图4图4：30℃条件下五个样的上清和沉淀

1: 301上清，2: 301沉淀，3: 302上清，4: 302沉淀，5: 303上清，6: 303沉淀，
7: 304上清，8: 304沉淀，9: 305上清，10: 305沉淀

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发表于 2013-6-1 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图5图5：23℃条件下五个样的上清和沉淀

1: 231上清，2: 231沉淀，3: 232上清，4: 232沉淀，5: 233上清，6: 233沉淀，
7: 234上清，8: 234沉淀，9: 235上清，10: 235沉淀

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小中大

图6图6:不同温度下的最优可溶表达

1: 234上清，2: 234沉淀，3: 303上清，4: 303沉淀，5: 373上清，6: 373沉淀，
由图5可知：23℃条件下，明显的提高了上清目的蛋白的含量，并且，存在可溶表达平衡，即20个小时后，蛋白表达将以包涵体的形式存在，即不论如何改变条件，可溶表达已经达到极限。所以无需探索更低温度等条件。(个人观点，不知道是否正确)

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发表于 2013-6-1 13:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

四、大量制备，表达与纯化
配置1L LB液体培养基，分装成100mL×10瓶，分瓶以利于大肠杆菌生长和后续操作。
诱导培养：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL×5管液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL×10瓶液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。取出1 mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，23℃，90rpm条件下，继续振荡培养20小时。
破菌收集上清：分别离心（4℃，12000g，5min）加8mL×10管 PBS（pH 7.0）缓冲液重悬后，冰浴条件下超声波破碎（400W，15s，45s，30min），分别离心（4℃，12000g，15min）收集上清（8mL左右×10管）。
稀释过滤上清：将8mL左右×10管菌液用 PBS（pH 7.0）缓冲液稀释为2倍，并过0.45纳米滤膜。取1mL留样。
过镍柱纯化：（8mL左右×10管×2倍=160mL，分2次过柱，每次80mL）
A、用缓冲液I （PBS pH 7.0缓冲液）平衡镍柱，5个床体积，流速为2mL/min。
B、将稀释过滤后的上清上样，流速为1mL/min。
C、用缓冲液I （PBS pH 7.0缓冲液）再洗5个床体积，流速为2mL/min。使目标蛋白充分挂柱。
D、用含50mM咪唑的缓冲液III，洗去杂蛋白，流速为2mL/min。并收集洗杂峰。
E、用含100mM咪唑的缓冲液III，进行洗脱，流速为1mL/min。并收集洗脱峰，收集洗脱液。
F、将收集的洗脱液用15mL超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装成每管1.5mL，取1mL 4℃备用，其余-80℃保存。
G、各取1mL 过柱前、挂柱穿透、洗杂液、洗脱液加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图7蛋白质过Ni柱电泳图示

1: pET-32aA3诱导全菌，2: pET-32aA3诱导沉淀，3: pET-32aA3诱导上清，4: Ni柱穿透，
5: 50mM咪唑洗杂蛋白，6: Ni柱洗脱（纯化的蛋白），7: 超滤离心管浓缩的蛋白
全图：

1: pET-32a未诱导，2: pET-32a诱导，3: pET-32aA3未诱导4: pET-32aA3诱导，
5: pET-32aA3诱导沉淀，6: pET-32aA3诱导上清，7: Ni柱纯化的蛋白，8: Ni柱纯化的蛋白

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五、Western Blot
（过程下次补上）

六、多克隆抗体的制备
纯化蛋白加等量的弗氏完全佐剂进行乳化使之形成油包水乳剂（我用枪吹了2个多小时），采用皮下、皮内和肌肉注射的方法进行第一次家兔免疫。再次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，最后一次静脉加强免疫时则不用佐剂。每次免疫抗原量为400 -500g/次（1mL左右），最后一次加强免疫7-10 d后采血。将所采血4℃凝结过夜，取血清(3000rpm 10~15min)，加入NaN3后于4℃保存（我是直接-80保存，什么都没加）。用琼脂双扩散的方法测定抗血清效价（还没做）
七、什么什么效价（还没做）
用琼脂双扩散的方法测定抗血清效价

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WB我做了一次就成功了，步骤没电子版的，现在实验在多抗制备阶段，琼脂双扩散的方法测定抗血清效价还没研究，希望大家的帮助
感谢楼主等各位高手的帮助。。希望新手少走弯路

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