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标题:【求助】没有蛋白的磷酸化抗体，如何检测一个蛋白的...

雪原[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】没有蛋白的磷酸化抗体，如何检测一个蛋白的...

我准备检测RIP1蛋白的磷酸化水平，但是市面上没有磷酸化RIP1抗体，那么如何检测RIP1的磷酸化水平？

我看文献上讲用的是IP的方法，但是沉淀后的免疫复合物如何去跑电泳呢？

是分别用RIP1的抗体和磷酸丝氨酸的抗体做一抗吗？

而且查了资料和文献，磷酸丝氨酸的分子量也没有？

难道是先做RIP1的电泳，然后洗脱，然后在同一个蛋白大小的位置再去检测磷酸化？

请高手明示！
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 小中大

磷酸丝氨酸的抗体做一抗
只要是发生丝氨酸磷酸化的蛋白都能被检测到
不针对特异性的蛋白，而是针对丝氨酸发生磷酸化的序列
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发表于 2013-6-1 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提供个方案供参考。
用RIP1蛋白的抗体做IP（需要确定你的抗体适合做IP），免疫沉淀复合物加loading buffer煮样后，进行SDS-PAGE，Western用泛抗丝氨酸磷酸化抗体，检测RIP1蛋白对应分子量位置的条带情况。间接说明RIP1蛋白的磷酸化
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发表于 2013-6-1 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的，现在有没有好用点的anti-ser抗体啊？
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 小中大
用同位素吧，32P，这个比较靠谱。anti-ser没有好用的，现在好用的抗体只有针对酪氨酸磷酸化的。还可以打质谱。
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发表于 2013-6-1 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
磷酸丝氨酸的抗体做一抗
只要是发生丝氨酸磷酸化的蛋白都能被检测到
不针对特异性的蛋白，而是针对丝氨酸发生磷酸化的序列

=================================

我想做IP的阴性对照 请问你知道怎么做不？
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发表于 2013-6-1 13:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提供个方案供参考。
用RIP1蛋白的抗体做IP（需要确定你的抗体适合做IP），免疫沉淀复合物加loading buffer煮样后，进行SDS-PAGE，Western用泛抗丝氨酸磷酸化抗体，检测RIP1蛋白对应分子量位置的条带情况。间接说明RIP1蛋白的磷酸化

==============================================================

十分感谢

另外，我还准备检测RIP蛋白的泛素化，也是用IP的方法，

请问，方案如何设计？条带是剪RIP蛋白的地方，还是泛素分子的地方，还是整个膜？

我看有文献测的是整个膜的，不是很理解！

再次感谢
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发表于 2013-6-1 13:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

ub贴在RIP蛋白的赖氨酸残基上形成泛素化，western 检测可见分子量不等的ladder,所以你要剪的条带是RIP蛋白分子量以及其分子量以上的地方
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

cuturl('http://www.bl-biotech.com/ArticleShow.aspx?ArticleID=95&ChannelID=11'),磷酸化丝氨酸的资料，请您详看、
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-6-1 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，您好，我现在做实验也遇上没有相应蛋白的磷酸化抗体，请问您的实验现在进行如何？能否分享一下经验，谢谢，万分感谢
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