小中大不用跑电泳！
其实做个DOT 实验就可以验证到底问题出在哪里，因为不外乎就是可能出在三步上：1）一抗没和目的蛋白结合 2）二抗没和一抗结合 3）显色步骤有问题。
将目的蛋白，一抗，二抗少量（几微升，根据你的样品而定） 分别点在三小块NC膜上，为 A，B，C；然后用封闭液封闭；A 膜与含适当滴度的 一抗溶液进行杂交1 小时（一抗滴度要保证足够量，可以按说明书上的最大量，如果是自制的可以1：100 等保证足够结合，时间根据你的实验情况定），PBS 润洗；A、B 膜同时与含适当滴度的二抗溶液杂交，同样二抗也使用说明书上推荐的最大量，确保足够结合，PBS 润洗；A，B，C 膜 与 DAB 溶液 作用，DAB 也使用说明书上推荐的最大用量。
然后观察颜色反应，就知道是哪一步出现问题了。
C 没有颜色，则是 二抗和DAB 作用时出现了问题；C 有颜色，而B无颜色，则是二抗和一抗作用时出现问题；C 有颜色，B 有颜色 ，而A 无颜色，则是一抗和目的蛋白不能结合上。
以上的方法是一位高人指点的，我们也曾这样做过，效果不错！
照上述方法试试吧。
祝你成功
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好像A、C可以，B的检测不行吧，A上有固定的蛋白来结合一抗，ＰＢＳ－Ｔ洗涤时结合上一抗不掉，二Ｂ上的一抗会被洗掉的说。
