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标题:【求助】上清有少量表达，包涵体大量表达....

摆渡客[使用道具]
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发表于 2013-6-3 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】上清有少量表达，包涵体大量表达....


最近在做GST融合蛋白表达。先考虑的是可溶表达，跑SDS_PAGE,考马斯亮蓝染色后看不出来，做了WB，发现有目的蛋白表达。又跑了沉淀，目的条带很明显。也就是说，目的蛋白大量表达在包涵体里面，上清里的很少。之后做了很多的优化，包括调整IPTG的量，改变诱导温度和时间（但是没有低温摇床，诱导温度最低只能是室温），改变加诱导剂前菌体OD，目的就是想提高上清蛋白的表达量，但是效果不明显 --------考虑到GST蛋白变性复性的复杂，很纠结，不知道该怎么做----各位大虾遇到这种上清有表达，包涵体也有表达的情况是怎么做的？？？？现在真是纠结的很！还望各位不吝赐教！小女子谢过了！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-6-3 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那就先纯化上清看看,能得到就不做复性,如果不能避免再做.
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2013-6-3 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

换 载体, 宿主，Tag试试看。
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发表于 2013-6-3 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那就先纯化上清看看,能得到就不做复性,如果不能避免再做.

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我纯化了两次上清，结果都不好。我怀疑是不是我的纯化技术不好？打算再做一次。（不好意思我老是对自己的实验结果没信心，老想重复）
另外，楼主觉得我大量诱导菌体后纯化上清得到目的蛋白的可能性大吗？
谢谢斑竹！
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 小中大
换 载体, 宿主，Tag试试看。

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我也想换载体试试，比如pet载体，但是考虑到GST表达系统表达得到可溶蛋白的可能性更大，而且T7启动子的强度好像比tac启动子高，所以觉得可行性不大----
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 小中大

if you just want to get the antibody, you do not need refold.
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发表于 2013-6-3 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

知音啊，我都停留在这个上面一个月了。我做了不同温度及不同浓度IPTG诱导，但将上清过柱纯化后，SDS-PAGE，染色后只见白板。而沉淀却有较浓的条带。现在正在考虑是否进行包涵体复性呢。
楼主继续加油！
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发表于 2013-6-3 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你想想办法看能不能低温表达吧，不如接摇床试一试
还有就是可以换下菌株，如origami
实在不行的话，复性也不就不需要带GST了，融合GST就是为了可溶表达，既然不行的话，就不带GST，复性更好进行些，可以考虑带His-tag，柱上复性。
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 小中大

个人感觉，如果使用GST的融合蛋白诱导后大量出现于包涵体中，再去摸索减少包涵体的条件不太现实了，我曾经遇到过这样的问题，最后尝试过无数种组合（低温诱导，IPTG浓度梯度，加入蔗糖促进分子伴侣蛋白表达等）后，只能硬着头皮去摸索包涵体的变性复性，做出来才发现其实直接搞定包涵体才是最快捷的方法，但是很多人在遇到包涵体的第一反应却是怎么避免它的出现。
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qiangren789[使用道具]
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发表于 2013-6-3 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以换个菌株试试。或者不加IPTG，做个自诱导表达看看。
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