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标题:【求助】GST融合蛋白纯化

人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】GST融合蛋白纯化


大家好，我最近纯化GST融合蛋白，可纯化后融合蛋白很少，杂蛋白却很浓，详见下图。使用的树脂是Pierce Glutathione Agarose，纯化方法是batch method 。采用超声破菌，超声裂解液是50mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0，同时含有1%甘油、0.1%Triton X-100、1mM DTT和1mM PMSF，超声参数是功率500W，超声2S、间歇2S，循环100次，其中超声破碎仪最大功率为1000W。请高手帮忙分析原因，在下感激不尽！


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2013-6-3 17:09
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.对比L和FT，你的蛋白应该挂柱成功了，建议跑个Beads看看是不是没洗脱下来。
2.你标记的杂蛋白从分子量看像GST，貌似有GST tag掉落的现象
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发表于 2013-6-3 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

树脂已经再生了，只能下次做纯化时留些跑电泳看看。如果是GST标签掉落，是融合蛋白降解所致吗，有什么方法可以避免吗？
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zhenxin[使用道具]
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 小中大

会不会是大部分只表达了GST标签后就终止了呢？你的目的蛋白有无什么难表达的序列或是稀有密码子过多？
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人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
会不会是大部分只表达了GST标签后就终止了呢？你的目的蛋白有无什么难表达的序列或是稀有密码子过多？

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编码序列中有稀有密码子，用的表达菌就是Rosetta
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987789[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
编码序列中有稀有密码子，用的表达菌就是Rosetta

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Rosetta也不是万能的，我遇到过一些蛋白稀有密码子过多，连Rosetta也无法表达。
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人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-6-3 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

诱导后在融合蛋白处相对于诱导前多出一条带，另外我做western blot 也证实确有融合蛋白表达，所以应该不是蛋白不表达。我现在的问题是为什么洗脱后杂蛋白比融合蛋白还浓，另外杂蛋白看上去也像GST标签，不知是如何脱落的？
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发表于 2013-6-3 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
诱导后在融合蛋白处相对于诱导前多出一条带，另外我做western blot 也证实确有融合蛋白表达，所以应该不是蛋白不表达。我现在的问题是为什么洗脱后杂蛋白比融合蛋白还浓，另外杂蛋白看上去也像GST标签，不知是如何脱落的？

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降解了，破菌时加5mM EDTA应该有改善。

大肠杆菌里金属蛋白酶较多，PMSF没用的
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发表于 2013-6-3 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
降解了，破菌时加5mM EDTA应该有改善。

大肠杆菌里金属蛋白酶较多，PMSF没用的

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你的意思是在在超声液里加EDTA?
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发表于 2013-6-3 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的意思是在在超声液里加EDTA?

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如果过镍柱的话不能加EDTA, 柱子会直接脱镍失效

这也是GST, MBP之类层析的优点
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