蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】镍柱纯化蛋白有杂带，做了梯度没有改善

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 17  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】镍柱纯化蛋白有杂带，做了梯度没有改善

KGZ564[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74472
精华 0
积分 452
帖子 583
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
1

发表于 2013-6-3 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】镍柱纯化蛋白有杂带，做了梯度没有改善

左一为Marker，左二为全菌裂解液，左三为细菌裂解液过镍柱后的流穿液，右边三个为第一二三毫升的洗脱液。纯化的上面一条是目的蛋白，下面为杂蛋白，流穿液里面含有大量的目的蛋白。做了binding buffer和elution buffer梯度浓度了，结果没有改善。 我采用的是康为世纪的Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，请帮忙分析原因，以及接下来如何优化？谢谢！！！！！


查看积分策略说明
附件
2013-6-3 17:26
10112012.snap.jpg (36.01 KB)
 
顶部
vivian4123[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75243
精华 0
积分 417
帖子 494
信誉分 100
可用分 3331
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2

发表于 2013-6-3 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

采用载体为pET43.1a(+),表达菌为Rosetta.表达蛋白是可溶蛋白。接下来需要打兔子做抗体，请问如何优化？小女子新人一个，求解释！
顶部
IAM007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75217
精华 0
积分 464
帖子 608
信誉分 100
可用分 3861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3

发表于 2013-6-3 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

综合看来你的目的蛋白挂柱能力不强，可以在你得目的序列里再加一些his标签、、我的蛋白纯化后也是有杂带，别人教我说把wash buffer 的浓度提高一些，我还没试过，你可以做一下
顶部
KGZ564[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74472
精华 0
积分 452
帖子 583
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
4

发表于 2013-6-3 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
综合看来你的目的蛋白挂柱能力不强，可以在你得目的序列里再加一些his标签、、我的蛋白纯化后也是有杂带，别人教我说把wash buffer 的浓度提高一些，我还没试过，你可以做一下

==========================================================================================================

梯度我都做过了，没有明显改善。估计是杂蛋白和镍柱结合能力强过我的目的蛋白吧。现在打算再切胶纯化。我在纠结用考马斯染色还是KCl染色。。。。有没有人指导一下?
顶部
IAM007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75217
精华 0
积分 464
帖子 608
信誉分 100
可用分 3861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
5

发表于 2013-6-3 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 KGZ564 于 2013-6-3 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
综合看来你的目的蛋白挂柱能力不强，可以在你得目的序列里再加一些his标签、、我的蛋白纯化后也是有杂带，别人教我说把wash buffer 的浓度提高一些，我还没试过，你可以做一下

=========================================== ...

我们没做过切胶纯化，跑胶的时候不都加了变性剂了么？？用非变性胶跑，我们组两种染色都做过，kcl染色后的带看着不是很清楚
顶部
am10[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2013-6-3 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

切胶回收吧，省钱省事量大 ，KCL染色
顶部
mysmdbl[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77053
精华 0
积分 314
帖子 327
信誉分 100
可用分 2446
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
7

发表于 2013-6-3 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你买的试剂盒里的成分是什么，有盐和表面活性剂吗
顶部
KGZ564[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74472
精华 0
积分 452
帖子 583
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
8

发表于 2013-6-3 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 am10 于 2013-6-3 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

切胶回收吧，省钱省事量大 ，KCL染色

我也打算切胶回收，不过，就是要切太多胶了，因为一次性要免疫20只鸡，免疫一次要切胶30块了吧，工作量很大，实验室又没有大胶。请问KCL染色切胶的方案能不能发给我呀？
我同时也打算做个分子筛，不知道有没有意义。
顶部
jiushikeshui371[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108894
精华 1
积分 312
帖子 299
信誉分 102
可用分 2258
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
9

发表于 2013-6-3 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的蛋白表达量不低，不需要做切胶纯化吧。

我看了看康为世纪的试剂盒，Binding Buffer的咪唑浓度是10mM,你可以把咪唑完全去掉，然后增加细胞裂解液和层析填料结合的时间，或者干脆让层析填料放到细胞裂解液中去，室温在脱色摇床或者别的上面震荡结合，以提高结合能力。

然后你洗脱的时间梯度选的可能不是很合适，首先你要用较多的5～10CV的Binding Buffer来洗去未结合蛋白，然后逐渐增加梯度洗去杂蛋白，左4道 洗下来的是杂蛋白，可以用这个浓度多洗，或者再优化一下梯度。最后用较高的咪唑浓度洗脱目的蛋白。

好不容易做了构建，表达了可溶性蛋白还切胶纯化是不是有点浪费？
顶部
KGZ564[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74472
精华 0
积分 452
帖子 583
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
10

发表于 2013-6-3 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jiushikeshui371 于 2013-6-3 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的蛋白表达量不低，不需要做切胶纯化吧。

我看了看康为世纪的试剂盒，Binding Buffer的咪唑浓度是10mM,你可以把咪唑完全去掉，然后增加细胞裂解液和层析填料结合的时间，或者干脆让层析填料放到细胞裂解液中去，室温在脱色 ...

主要是杂志的结合能力太强了。做了所有浓度的梯度优化，都没有改善。切胶很痛苦，要切好多，我也不想的。构建的时候，只在中间有一个组氨酸标签。这是之前前辈的构建方式，我只是修改了片段拿来用而已。没想到这个影响挺大的。我真不知道之前的人之怎么过柱纯化出来的。
顶部
 17  1/2 12››