蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】BL21(DE3)表达出现非特异性带

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】BL21(DE3)表达出现非特异性带

eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
1

发表于 2013-6-3 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】BL21(DE3)表达出现非特异性带


用的PET32A作为载体表达，IPTG浓度为0.8mM.诱导不同时间取样。
A蛋白不加标签大小：18.5KD
B蛋白不加标签大小：18.4KD
结果同样的PET32a也有条带，条带大小与预期的相当，是什么原因？怎么解决？
??


查看积分策略说明
附件
2013-6-3 18:11
99386665.snap.jpg (19.21 KB)
 
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2

发表于 2013-6-3 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
通读了？终止密码子有无问题？
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
3

发表于 2013-6-3 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在构建载体的时候确实去除了PET32a的终止密码子，有影响吗？但是我查看了PET32A的下游HIS TAG后面是有终止密码子的，应该没有影响啊！
顶部
Ao7[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76545
精华 1
积分 647
帖子 790
信誉分 102
可用分 4976
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
4

发表于 2013-6-3 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

测序完之后，要用软件翻译一下你的序列，要是没问题的话再诱导表达。
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
5

发表于 2013-6-3 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同样的PET32a也有条带，条带大小与预期的相当，是什么原因？》这句话什么意思？

如果是说未诱导的组别也有表达，那么可能是你培养的时间太长即使不添加ITPG，也是会出现自诱导的本底表达。

如果是通过Ni纯化后，这个应该就是本底表达的目的蛋白。
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
6

发表于 2013-6-3 18:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多少度诱导的啊 你这条带也太纯了吧 都不需要纯化了
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
7

发表于 2013-6-3 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同样的PET32a也有条带，条带大小与预期的相当，是什么原因？》这句话什么意思？

如果是说未诱导的组别也有表达，那么可能是你培养的时间太长即使不添加ITPG，也是会出现自诱导的本底表达。

如果是通过Ni纯化后，这个应该就是本底表达的目的蛋白。

==============================================================

这个是western-blot的图，用的HIS-TAG抗体染的，空载体也有带，不太清楚为什么。
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
8

发表于 2013-6-3 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多少度诱导的啊 你这条带也太纯了吧 都不需要纯化了

=============

这个是WB的图
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
9

发表于 2013-6-3 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个是western-blot的图，用的HIS-TAG抗体染的，空载体也有带，不太清楚为什么。

===========================================================================================

觉得应该是培养时间过长，产生的本底自表达。你可以试下用不含你的目的基因的空载体做个表达对照，看看有无同样的条带。
顶部
lxh031[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76425
精华 0
积分 335
帖子 389
信誉分 100
可用分 2726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
10

发表于 2013-6-3 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

遇到了相同的问题，想问一下楼主怎么解决的?

12是不是空载体啊
顶部
 12  1/2 12››