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标题:【求助】纯化蛋白遇到了很多问题，郁闷死了

she[使用道具]
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发表于 2013-6-4 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】纯化蛋白遇到了很多问题，郁闷死了


最近看了论坛里有很多纯化方面的大师，小弟目前也遇到了些纯化方面的问题，希望大师们给小弟点意见

我用的蛋白纯化系统是halotag蛋白纯化系统，这套系统好像用的人不多，原理是这样的：目的蛋白和halotag标签形成融合蛋白，标签会和resin形成共价结合，结合在resin上的蛋白需要用TEV酶切才能把目的蛋白切下来。
我现在遇到的问题是切下的目的片段大小是正确的，就是做western怎么都检测不出来。我把实验从头说起，请大家耐心的看下

蛋白的表达。我是按照操作手册做的，表达后有条43KD的片段明显增多，应该是表达出来了，我把细胞裂解液做了western，证明有我的蛋白。并且用tev蛋白酶切细胞裂解液，也证明切出了halotag标签。但是用resin上柱后，发现大部分蛋白仍在流穿夜中。由于蛋白和resin 共价结合，没办法通过跑胶检测蛋白是否挂到resin上了，我用TEV酶切柱子，洗脱下了一个很淡的约8kd的片段，有些弥散，我的目的蛋白大小也是8kd。但是这个片段用western怎么都检测不出来，也打了质谱，发现没有我的片段

后面我又重新做了克隆，在C端连了his。用his纯化方法。但是发现his上柱后，大部分蛋白仍在流穿夜中，但是跑his柱发现上面还是结合了不少43kd左右的蛋白，比较浓。然后用TEV酶切，也切出了曾经看到的那条8kd的片段，用western仍未检测出来。现在可郁闷了。

大家先看看，我一下子说多了大家会看腻烦的，我后面会慢慢补充，
小弟在这里先谢谢大家乐

补充：我用的是KRX感受态，鼠李糖诱导表达。
通过比较总的细胞裂解液和离心后的细胞裂解液，发现没有形成包涵体
融合蛋白的PI值是5.0 缓冲液PH是7.5
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ffooll[使用道具]
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发表于 2013-6-4 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大概帮你分析了一下。
首先，蛋白的表达量可能非常大，可能超过了柱子的载量。通过后面你说的his tag纯化时可以看出，大部分蛋白穿过了，依然能有很多结合在镍柱上。你可以尝试增加镍柱体积，然后延长孵育时间，让蛋白和柱子多结合一段时间（就像纯化GST蛋白一样，多孵育一会），看是否有提高。根据经验，一般可以改善不少。
其次，你的蛋白有可能结合核酸之类的东西，阻碍了它与柱子结合。我之前做过这类蛋白，结合核酸非常厉害，破碎前要加入核酸酶，然后过镍柱时还要孵育很久，后面还要过离子柱去核酸。或者用一种聚合物叫PEI，具体加多少哦，需要摸索。如果实验室有钱，可以买磷酸纤维柱去除核酸。
第三，关于TEV酶切这一步。你后来纯化出的带his tag的，酶切完了用质谱能检测到蛋白吗？只看到你说western做不出。如果质谱可以检测到，那就是western这一步出问题了。至于western的问题，版上有很多讨论帖。
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she[使用道具]
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发表于 2013-6-4 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ffooll 于 2013-6-4 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大概帮你分析了一下。
首先，蛋白的表达量可能非常大，可能超过了柱子的载量。通过后面你说的his tag纯化时可以看出，大部分蛋白穿过了，依然能有很多结合在镍柱上。你可以尝试增加镍柱体积，然后延长孵育时间，让蛋白和柱子多结 ...

谢谢你的答复
我重新加大柱子量了，也延长了上柱时间，但是没有一点起效，柱子的结合效率还是那么多，流穿夜中还是有那么多目的蛋白

用目的蛋白的抗体和his抗体都检测了柱子上的蛋白，证明是我的目的蛋白。但是经过TEV酶切之后，在8KD的位置依然有一条很明显略有弥散的带，做了两次western都没做出来，以前用另一种方式纯化（不是his纯化）的打过质谱，没有我的目的蛋白。现在有点担心，不知道能不能打出来
我有点疑问，我酶切后蛋白酶没有去处，和目的蛋白放在一起会把目的蛋白降解吗？

还有，你说核酸会影响上柱，那我如何能证明呢，我必须先证明是核酸引起的才能取申请买材料
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8princess8[使用道具]
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发表于 2013-6-4 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

按理来讲，你已经得到自己要的蛋白了，只是WB没有检测出来。
8KD的蛋白做WB不知道你是怎么做的，这个也是蛮讲究的，包括转膜的孔径大小，转膜的时间都需要控制好。比如一个80kd的蛋白WB与一个16KD的蛋白做WB，这方面的参数是完全不一样的，以前我曾因为这个问题废了不少事情，不知道这位哥们做WB注意到这些细节没有。
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she[使用道具]
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发表于 2013-6-4 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2013-6-4 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

按理来讲，你已经得到自己要的蛋白了，只是WB没有检测出来。
8KD的蛋白做WB不知道你是怎么做的，这个也是蛮讲究的，包括转膜的孔径大小，转膜的时间都需要控制好。比如一个80kd的蛋白WB与一个16KD的蛋白做WB，这方面的参数是完 ...

之前我用一个6kd的蛋白做阳性对照，western做出来了，所以我一直没有怀疑过我的western，而且之前用halotag纯化系统纯化蛋白，也切出了8KD片段，但是打质谱却没有我的蛋白。
这次用his纯化，考染现象都一样，western仍做不出来，准备打质谱，但心里没有底

我做western用的是0.22um孔径的pvdf膜，350的电流，75分钟，我确定用立春红染不出这条8kd片段，但能然出阳性对照6kd片段，而且我的目的蛋白浓度很高

不知道哪里还需要改进，请大侠提点意见
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-6-4 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Halo Tag我用过，或许可以解答一下。
1：蛋白与填料结合的检测：你可以将结合了Halo融合蛋白的填料取10ul，加入SDS PAGE Loading buffer，煮10min，点样。这样你的蛋白可以被煮下来。
2：蛋白与填料结合的效率：这个问题你应该看看填料的说明书，按照里面推荐的结合buffer来操作，因为是共价结合的，因此buffer会有影响。你可以先试一下优化。而且，蛋白穿透出来很正常，因为不排除有折叠不正确的会挂不上柱。
3：8kd的蛋白western测不到：你之前用细胞裂解液做的western是用什么抗体做的？抗Halo吗？还是抗你这个蛋白？8kd的东西可能转膜什么的会有点难度，你可以试一下用酶切之前的蛋白做一次Western，看看能不能测出你这个8kd的东西。
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 小中大


QUOTE:
原帖由 kuaizige 于 2013-6-4 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Halo Tag我用过，或许可以解答一下。
1：蛋白与填料结合的检测：你可以将结合了Halo融合蛋白的填料取10ul，加入SDS PAGE Loading buffer，煮10min，点样。这样你的蛋白可以被煮下来。
2：蛋白与填料结合的效率：这个问题你应该看看 ...

谢谢您的帮助。halotag标签和柱子是共价结合的，无法通过煮样让蛋白与柱子分离，所以你说的那个方法跑胶里面是空的。
也就无法观察柱子上是否有蛋白
您是怎么做的？
我蛋白是融合蛋白，用了两种抗体都抗过，都没抗出来
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 小中大

楼主的第二次纯化时设计了 C-terminal His tag，所以可以尝试一下酶切前后的样品同时用His antibody（酶切后仍然带His tag吧） 及 target Protein antibody 做 Western blot，
先确认一下能否检测得到吧。
或许8kDa的那个带就不是目的带。
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DNA[使用道具]
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发表于 2013-6-4 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 she 于 2013-6-4 10:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


谢谢您的帮助。halotag标签和柱子是共价结合的，无法通过煮样让蛋白与柱子分离，所以你说的那个方法跑胶里面是空的。
也就无法观察柱子上是否有蛋白
您是怎么做的？
我蛋白是融合蛋白，用了两种抗体都抗过，都没抗出来 ...


煮是可以煮下来的，因为SDS破坏了halo的高级结构，这个我试过。如果你煮出来是没东西的话，可能就是没挂上了。融合蛋白用两种抗体都抗不出来，你有没有做过阳性对照？抗体没问题吧？抗his的有没有做过？还有序列正确否？
如果western还是做不出来，还有一个方法，直接用你的融合蛋白和你的抗体做结合反应，然后跑非还原非变性较，看看条带有没有迁移，这样可以判断蛋白和抗体有没有结合
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she[使用道具]
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发表于 2013-6-4 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
煮是可以煮下来的，因为SDS破坏了halo的高级结构，这个我试过。如果你煮出来是没东西的话，可能就是没挂上了。融合蛋白用两种抗体都抗不出来，你有没有做过阳性对照？抗体没问题吧？抗his的有没有做过？还有序列正确否？
如果western还是做不出来，还有一个方法，直接用你的融合蛋白和你的抗体做结合反应，然后跑非还原非变性较，看看条带有没有迁移，这样可以判断蛋白和抗体有没有结合

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不好做哦，我的洗脱液里洗脱下来的蛋白里有TEV蛋白酶，这个酶很奇怪，和我的蛋白抗体结合啊，而且带非常亮。这个会干扰的
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