小中大(三)密度梯度--材料和梯度型式的选用
1、 对于速率--区带密度梯度离心,梯心度选择要点
(I) 概述:用速率一区带法下简移尺R-z法进行分离的主要原理是依靠不同样品在梯度中沉降速率的不同来分离(比化样品,因此希望样品在沉降能通过整个离心管长度的提高分辨率。作为最基本条件就是梯度液的最大密度必须少于样品颗粒的密度。
用有密度梯度的支持液作R-z离心有以下优点:
*当样品中不同组份分层进入梯度液时,梯度的较高密度支持着样品这样就使样品各个不同密度的层次以较窄(或较薄)的区带沉降从而得到期较高的分辨率(或较高的纯度)
* 梯度液的密度一般是从离心管上部到底部逐渐增加,这样就可以稳定液栓,提示抗对和抗机械扰动的能力(接近离心过程结束时,纯样品区带和它的支持液的密度差较少)
* 梯度液粘性系数逐渐增大也使纯样品区带变窄从而提示了分辨率而逐渐减缓的沉降速度使同一组份样品逐渐靠扰,提高了分离纯度。
(II) 梯度、材料的选用
一个理想的梯液就具备:化学稳定性好;高溶合度;低渗透性;在溶剂中稳定性;较低的光吸收特性;价廉等。遗憾的是很难找到一种适合于各种R-z离心的完美无缺的梯度液。
对于大参数R-z离心,蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度(>30% W/N)时粘性每数较大,但综合比较表明它可以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度时(即使是低密度时也如此)右较高的渗透性,分离一些对渗透性敏感的生物体组份时需要选择其他梯度材料,如由pharmacia公司开发的Ficoll等等。
在大多数情况下,梯度液的PH值应与被分离时生物样品的生理PH值一致。
对密度梯度材料的基本要求:
a) 能够配制所需要的密度范围
b) 粘性系数较低
c) 溶合度高
d) 有密度与光折射率的对照资料
e) 对被分离样品无损害
f) 对被分离样品渗透很少
g) 在离分离完成后很容易与生物样品分离
h) 化学了性放稳定
i) 对离心过程中所接触的转头材料,离心管,管盖及密材料,连续流及区带转头的管道等等无腐蚀作用
j) 纯度高
k) 毒性少
l) 价格较低
m) 已知该材料的某些物理、化学、热力学性能。
常用的梯度材料有:蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾、氯化铯、氯化铷、硫酸铷、三氯(耳苯酸钩、三氟醋酸铯、右旋糖苷,白蛋白、Ficoll, percoll, mettizamide, Nycodebnz, Ludox, Dextian等等
(III) 梯度形状的选择:
所谓梯度形状是指梯度介质没着离尽管长充方向的密度变化特征。
用于R-z离心密度梯度常用连续梯度也变是密度随着离心本径的增加而光滑地(不是实变化)增大,直线型的,光滑曲线型的(一般用凸指数或凹指数曲线,或凸凹指数曲线联用的)都属于连续梯度。不连续(阶梯型)梯度采用于等密度离心。
*线型:
在甩平转头中做R-z离心最常用线性梯度。
制各线性梯度时要注意:
(a) 在甩平或垂直转头中制各线性梯度时,梯度液西的密度必须足支持样品,而底部密度必须少于被分离样品组份的密度。
(b) 一般地说较大的梯度斜率可以得到较高分辨率
(c) 蔗糖的常用线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V
(d) 可以用梯度议制各线性梯度,也可以人工辅设整个价梯型梯度,离心管二静置一致时间后也可以形成近线性梯度。
*等运动梯度(等速梯度)(Isokinetic)
等运动梯度是指在某一恒定离心转速时,样品颗粒在梯度中以定常速度沉降。在做到等速沉降,必须使梯度和粘性力的增加与沿着离心本径方向的离心力增加相平衡,在这种梯度液中,颗粒的沉降距离与离心时间,离必力,以及颗粒本身的沉降多数成正比。因此如果已知某单一组份样品的沉降分数,就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。
在甩平转头中用等速沉降梯度时,从旋转中心算起的离心距离与沉降系数的关系应该是线性关系。
为了构造等速沉降梯度种慢必须注意到转头、离心管,梯度合质的密度,浓度和粘性系数在同一温度。
在甩平转头中作蛋白质分离常用5~20%(W/V)的蔗糖梯度在5摄氏度离心可以达到近似的等速沉降的效果,而10~30%(W/V)的甘油梯度在5摄氏度时分离DNA或RNA也可以达到近似等速沉降的目的其他大金数样品分离的等速沉降梯度是凸指数型曲线。
*凸型指数曲线与凹型指数曲线梯度:
为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度,我们常常望梯度曲线在近度面处有较陡的斜率,也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸指数曲线梯度,与比相反,如果液面处梯度液足以支持(托住)样品,故虑到某些样品在离心管中下部需要较慢的沉降率(在高密度区)才能得到理想的分辨率,那么凹型指数曲线型梯度变能满足这个要求。
*复合型梯度:
如果用程序梯度仪来制备梯度,那么上节中的凸凹指数曲线梯度可以复合在同一梯度液中,这样的复合梯度在它们各自的区域保持了它们各自的优点。当然也制备其他类型的复合梯度。一般说,复合梯度多用于区带离心。
(2)等密度离心,梯度要素的选择:
(I) 梯度材料及梯度溶液选择:
所有的等密度离心都使用水溶性缓冲剂作溶剂,缓冲剂的组成及PH值取决于生物样品的性质。对细胞,亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离各有不同要求。
常用于等密度离心梯度材料有:
材料名称 DNA RNA 核蛋白 膜 亚细胞器 细胞 病毒
蔗糖 不适合 不适合 可用 较好 较好 可用 较好
Ficoll 不适合 不适合 不适合 可用 可用 最佳 较好
CSCL 最佳 较好 最佳 不适合 不适合 不适合 较好
Percoll 不适合 不适合 不适合 可用 较好 较好 可用
Nycodez 可用 可用 最佳 最佳 最佳 较好 较好