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标题:【求助】western背景高

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-6-4 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western背景高

各位战友，

最近作western，背景非常高，改变了几个条件，还是不行。
请大家会诊一下。
另外，大家是否碰到过这样的问题？都是如何处理的？
我注意到本版关于背景深的问题有不少战友提出过疑问，希望有经验的战友能够献计献策，指出对可能的原因，提供自己试验中消除背景的具体方法。帮助大家共同进步。

[ 本帖最后由 zhihui小新 于 2013-6-4 11:50 编辑 ]


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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-6-4 11:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样蛋白量30 60 100 ug，4度封闭过夜（包括室温下2h＋过夜），一抗室温1h，二抗室温1h, ECL显色结果背景都很深，整个膜都很亮。而目的条带都相对很浅，曝光时间从几s到1min，目的条带都很细。
开始考虑是封闭不好的原因，过夜封闭＋室温2h还不行。
考虑上样量太高了，做了一次预试，发现上样量10ug，看不到目的条带；20ug稍微有点影子；感觉30ug还可以，不能再少了。
考虑缩短抗体孵育时间和浓度。一抗用的是1：1000（santa cruze抗体稀释范围的最大值）；二抗用的是1：10 000。
洗脱时间10min*3次，感觉洗的应该非常干净了。

下一步，我想继续稀释一抗和二抗，上样量保持30ug。
请教有经验战友，有什么建议？
谢谢
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发表于 2013-6-4 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的ECL工作液孵育完后有没有用吸水纸吸取多余的工作液？你的整个膜都很亮，怀疑是否发光底物液残留太多。
个人觉得你的封闭应该可以（我都用室温2小时），一抗可以试着降低浓度（但你的背景那么高，觉得跟一抗关系不大），二抗1：10000也可以了。漂洗液加Tween了吗？封闭液、稀释液都用含Tween的漂洗液配，有助于降低背景。
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-6-4 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果洗干净了，ECL工作液是不会发光的。我的工作液不发光。
封闭液和稀释液都含有Tween。
今天又做了一次，明天发光，出了结果再向大家汇报。
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wood533[使用道具]
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发表于 2013-6-4 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

当然不能洗掉ECL工作液啊，只是用吸水纸把多余的吸去。另外，加完HRP-二抗后还是尽量多漂洗，我一般洗4－5次。不过没遇到过你这样高的背景的情况。希望你能找到不一样的原因。
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发表于 2013-6-4 11:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图文并茂，个人觉得可以是一个值得探讨的问题！所以先给tony1982加了一分。
希望大家能积极参与讨论。

ECL工作液可以用定性滤纸或者吸水力比较强的纸巾完全吸干。
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
ECL工作液体之所以发光，是因为二抗孵育后，没有洗干净，还有未结合的二抗与工作液反应显色。但是，如果洗的足够充分的话，工作液在暗室中是看不到的（没有颜色）。
我试过，当5min*3次洗脱时，ECL残留的工作液确实有荧光；但是，当我洗脱10min*3次时候，在暗室中ECL工作液就看不到光了。
请战友们继续讨论
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发表于 2013-6-4 12:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

肉眼与胶片。。。

不科学的问一下， 是否有数据可以说明他们之间感光程度的差异。。。。google一下 呵呵
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用的ECL底物是那个公司的？是GE还是Pierce？
个人认为你可以以30ug作为上样量，但是可继续提高一抗稀释比例（特别是如果你采用的是GE的ECL底物）1：3000，一抗牛奶4度过夜，二抗室温1h，依你的膜大小，考虑加ECL底物300ul-500ul

个人主要认为还是一抗稀释比过低
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831226[使用道具]
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发表于 2013-6-4 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们这里这段时间也出现了这种情况，我们用的一抗是杂交瘤上清，曝光出来也是背景很高，其它的和楼上说的基本相似。也很想搞清楚是什么回事。
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