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标题:【求助】关于提膜蛋白的这个配方?

nikun230[使用道具]
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【求助】关于提膜蛋白的这个配方?


我正在提取膜蛋白,在站内搜索到这个配方,有个地方不是很明确,望各位高手不吝赐教:
Buffer A:0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl(PH 7.5),120mM KCl,1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B:20mM HEPES(PH 7.5),10%甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。

配方中都出现两个EDTA,请问第二个是不是EGTA ,还是打错了?谢谢
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lxh031[使用道具]
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应该是发贴者的笔误,第二个应该是EGTA
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还是买个试剂盒省事。
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请教上述提取膜蛋白的配方适合细胞质膜还是包括质膜和细胞器膜蛋白?
我需要提取细胞器膜蛋白,用的去离子剂裂解液:
50mM Tris-HCl(PH 8.0),120mM NaCl,0.02%Sodium Azide, 100ug/ml PMSF, 1ug/ml Aprotinin(这个我没加),1%TrintonX-100。
我知道提取膜蛋白应该用非离子去污剂和低盐浓度,但配方还是有很多不同的地方。目前我WB还没有检测到目的蛋白,不知道上述配方是否存在问题?请战友帮助!谢谢!
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mickeylin[使用道具]
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我用提总蛋白和膜蛋白的方法都试过了,就是检测不到目的蛋白,同时作了BETA-ACTIN,可以做出来,我都开始怀疑一抗的问题了.
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我和你有同感,看了提膜蛋白的一些文献,就没发现配方完全一致的,大体差不多,量上还是存在差异的.
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7
 
我也用上述方法提过脂肪组织的膜蛋白,我觉得脂肪组织蛋白提的效果不是蛮好,因为脂肪组织一破碎在预冷的BUFFER里就上浮,短暂离心后,本来要弃上清的,就不好把握了,很担心把不该丢的也丢了.
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nikun230[使用道具]
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8
 
你提取的是内源性蛋白吗? 是细胞系还是组织?
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mickeylin[使用道具]
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回复 #8 nikun230 的帖子

是的,内源的组织的~~~~~~~~~~~~~
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standbyme[使用道具]
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学习了,最近正在提膜蛋白,用得是别人给的裂解液,成分是HEPES/KOH(pH7.6)、5mM MgCl2、10mM KCl、5mM EDTA、5mM EGTA、250mM 蔗糖。用此裂解液裂解的细胞1000g离心几乎离不下东西,溶液全部呈乳浊状,之后10000g离心也离不下沉淀来,不知是否裂解液配方错误?望各位高手多多共享交流
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