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标题:【求助】细胞色素C western blot求救

changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】细胞色素C western blot求救


各位前辈！
最近实验太郁闷了！我做细胞色素C（14KD）WB，电泳完了考染Marker15KD稍下有条带，转膜（半干，40MA、90分钟）后同样位置也有条带，一抗孵育（cell signal 1：500、4度过夜）二抗（cell signal 1：2000、室温1小时）孵育，暗室里膜的其他地方有荧光（可能没洗净）目标条带处无荧光，压片（30秒，1分、2分、3分、5分）后目标条带处空白，背景到有点黑。重复了7－8次都是这样，现在实在做不下去了，向大家求救！希望得到帮助，谢谢！
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我自己分析以下原因：
1.那条条带跟本不是我的目标条带
2.抗体无法识别抗原（可是免疫组化检测同样指标，用同样抗体有结果）
3.目标蛋白丰度太低（可我上样从30ul到100ul都没结果）
不知还有哪里有问题，请大家帮我分析一下，谢谢！
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发表于 2013-6-4 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞色素C在线粒体内，线粒体通路的细胞凋亡时释放到胞浆，所以还必须确保提取蛋白时破碎线粒体，可以用超声的办法。
此外注意预防过转（最好是0.22um的小孔膜），排除反白。
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢回复，我用的就是0.22的膜，转膜条件应该没问题，今天新提的蛋白，明天再试试
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LZ你好，我想向你请教做cyt-c的一些具体问题。
第一，我做的是脑组织，能够提取总蛋白之后做western吗？
第二，是否能够把总蛋白放在－80度，半年之后做
第三，哪个公司的抗体比较好一些
万分感谢！
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同样请教前辈们:
哪个公司的抗体比较好呢?
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any333[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只提取释放到细胞内的细胞色素C，而不破坏线粒体，不导致线粒体内的细胞色素C因人为的因素而释放到胞浆内，应该怎么办？
单纯的研磨？
超声？
还有别的办法吗？
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caihong[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

搭个车问
cytc 转膜50V 90min可以吗？还是更短一点好呢？
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S6044[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

小弟跟楼上的哥们有同样的疑问，怎么能排除线粒体中细胞色素c的影响，而WB测得就是胞浆中细胞色素c,
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#甜#[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有线粒体分离的试剂盒可供使用，可以将胞浆与线粒体分开。我用了试剂盒分离，但是没有做出来，不知是甚么问题？
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