小中大HPLC流动相溶剂的选择和缓冲液的配制-之配制
缓冲液的配置(最佳方法)
1.将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液(溶液A)
2. 用pH计确定或调节溶液A的pH。
3.将一定体积(如200mL)的有机溶剂B与由步骤2配制的溶液A(如800mL)混合，制成最终流动相(此处的有机相为20%)
4.检查最终流动相的pH(此步骤为选项) 由于测定含有有机调解剂的流动相pH计发生飘移，使其测定pH不很可靠.所以上面的步骤4一般只有在考察误差的主要来源时采用，大多数实验室皆略去此步骤。
另外要注意上表中调节剂的浓度，不适当的浓度和波长选择，会造成基线本底吸收太高，基线不稳，影响分析。要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵(pH5.16)做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。
综述
混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。
