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标题:【求助】这三种收细胞蛋白方法哪种要好些？

cbou876[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】这三种收细胞蛋白方法哪种要好些？


第一种：细胞先种在10cm培养皿里，等长满后，PBS洗，加裂解液，冰上裂解一段时间，细胞刮收集细胞液，移液到EP管，离心取上清

第二种：细胞先种在10cm培养皿里，等长满加入PBS，用细胞刮刮下细胞，将含细胞的PBS移液到EP管，离心弃掉上清收集细胞，往离心管里加裂解液，冰上裂解，再离心取上清

第三种：在培养瓶里待细胞长满后或种在10cm培养皿等长满后，弃去培养基，PBS清洗，胰酶消化，培养基终止消化，移入15ml离心管，离心弃去上清收集细胞，余步骤同第二步。
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 cbou876 于 2013-6-4 15:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一种：细胞先种在10cm培养皿里，等长满后，PBS洗，加裂解液，冰上裂解一段时间，细胞刮收集细胞液，移液到EP管，离心取上清

第二种：细胞先种在10cm培养皿里，等长满加入PBS，用细胞刮刮下细胞，将含细胞的PBS移液到EP管，离心弃掉上清收集 ...

感觉第二种与第三种方法相对于第一种的优点是：放EP管里的细胞加裂解液，裂解更完全

第二种方法我觉得在用PBS刮细胞时是否会机械性破坏细胞？

第三种方法：虽离心弃掉含胰酶的培养基，但是否会仍残留蛋白？
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发表于 2013-6-4 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一般是用第一种，如果是提总蛋白，操作比较简单，而且总蛋白量很多；

提核蛋白要用第二种，因为蛋白比较宝贵。

第三种没怎么用过，不好评价，不过感觉操作比较麻烦。
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cbou876[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2013-6-4 15:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我一般是用第一种，如果是提总蛋白，操作比较简单，而且总蛋白量很多；

提核蛋白要用第二种，因为蛋白比较宝贵。

第三种没怎么用过，不好评价，不过感觉操作比较麻烦。 ...

谢谢，不太清楚为什么核蛋白比较宝贵，提的时候要用第二种？是不是第二种方法不容易使核蛋白降解还是另外的原因？请指教
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
设想一下，如果加裂解液的话，细胞核和细胞质都被裂解了。。所以核蛋白试剂盒中分为核裂解和胞浆裂解两种不同的裂解液，所以要先用pbs刮蛋白，再分别加两种裂解液。还有就是细胞核的蛋白含量一般比较少。
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有，我用第一种方法的时候，刮下来的细胞会放到EP管中冰上静置15min，再裂解。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
设想一下，如果加裂解液的话，细胞核和细胞质都被裂解了。。所以核蛋白试剂盒中分为核裂解和胞浆裂解两种不同的裂解液，所以要先用pbs刮蛋白，再分别加两种裂解液。还有就是细胞核的蛋白含量一般比较少。

=========================================================================

你好，我用的是碧云天的强裂解液，货号是P0013B，详cuturl('http://www.beyotime.com/lysis-buffer.htm')

貌似说明上写对核蛋白和胞浆蛋白提取都很好，做P53的时候我就是用这个裂解液采用第一种方法的。

还有您的意思是说加核裂解的裂解液不会使胞质裂解吗？ 还是有点看不明白
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有，我用第一种方法的时候，刮下来的细胞会放到EP管中冰上静置15min，再裂解。

=================================================================================

我说的第一种方法是直接用裂解液加进去，冰上静置一段时间后刮的。不知道您是干刮的？还是用PBS刮的？
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huifeng0516[使用道具]
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 小中大
我也是加裂解液的，然后冰上静止5min，后挂下来到ep管里再静止15min，再离心。感觉这样也可以保证裂解充分。
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我提总蛋白的时候是用的beyotian强裂解液，和你的一样。我之前做过p65和ikb-a，要分离胞浆和胞核蛋白，用的也是beyotian的细胞核抽提试剂盒，估计你理解错了我的意思，我的意思是分离胞浆和胞核蛋白，可能我上面没说清楚。
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