【转帖】差异蛋白质组学的应用

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标题:【转帖】差异蛋白质组学的应用

@花开花落@[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

查阅文献不难发现差异蛋白质组学（以双向电泳+质谱为主干技术）的应用不外乎以下几种；
1，肿瘤标志物的筛选,肿瘤组织/细胞VS正常组织/细胞，病人血清VS健康人血清
2，药物功效分析，加药组VS对照组
3，疾病模型分析，疾病模型/转基因动物模型VS对照组
试想，对一个功能未明确的基因，是否能通过构建转基因亚克隆细胞模型，与对照组细胞进行差异蛋白组学分析，从而得出与该基因连锁作用的上游及下游基因？这种方法或许能在寻找信号转导通路及分子伴侣上有所帮助。
本人查阅文献能力较差，未发现国内有人按照此种策略研究基因功能，欢迎各位大虾参与讨论。

remenb[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你说的研究方法，实际使用的很多，比如 Berdichevsky A, Viswanathan M, Horvitz HR, Guarente L. C. elegans SIR-2.1 interacts with 14-3-3 proteins to activate DAF-16 and extend life span. Cell. 2006 Jun 16;125:1165-77.。

但是用差异蛋白质组学或者质谱的手段来分析的很少，所以这类文章你可能找到的不多。不过下面这个应该算一篇：Dong MQ, Venable JD, Au N, Xu T, Park SK, Cociorva D, Johnson J, Dillin A, and Yates JR, III (2007) Quantitative Mass Spectrometry Identifies Insulin Signaling Targets in C. elegans. Science 317: 660-3

yychen[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这里首先膜拜下楼上所提到的第二篇文章中的大牛JOHN YATES III, 虽然RUDI 已经成为我们新的偶像，但没有YATES对于质谱在蛋白质组学领域的应用的贡献，我们可能还停留在“蛮荒”时代。

而涉及到差异蛋白质组学，我也想谈一点点体会，差异蛋白组学的研究策略是目前功能蛋白质组学,疾病蛋白质组学,临床蛋白质组学,毒理蛋白质组学的基本模式.相对于全景式组成蛋白质组学而言其研究规模较小而生物学意义更具体,是目前应用最广的蛋白质组学研究模式。

1. 首先从研究模式来说， 2DE与质谱结合的技术只是比较传统的一种方式，现在更多的文章中应用的是shotgun技术，后者很好的弥补了2DE/MS方法的一些缺点，并且通量更高。

2. 其次从研究目标而言，目前比较热的领域包括了药物靶标发现，生物标志物的鉴定和确认，疾病的机制研究，基因的功能鉴定，机制调节功能，药物对器官的作用以及基因的特殊功能的发掘等等。

3. 在MCP的 The human plasma proteome这篇文章中对差异蛋白质的研究提出了一个新的问题， “Finding a molecule of analyte present at 10pg/ml among the albumin molecules present at 55mg/ml is like finding one individual human being by searching through the population of the entire world(1 in 6.2 billion).” 也就是说在很多情况下，真正的差异蛋白质的丰度很低，可以说的大海捞针，这也就对我们的研究方法的改进提出了新的要求。

4. 而涉及到楼主所说的研究手段，做的人少的原因有如下几点; 1)我们的疾病只有很少的是由单基因调控的（比如说夏家辉院士做的耳聋基因）; 2)mRNA 的丰度和蛋白质表达水平没有很高的关联程度; 3)基因产物受到了以下的一些调控基因连锁，细胞状态和环境的影响（比如说翻译后修饰），所以要通过差异蛋白质组学分析，从而得出与该基因连锁作用的上游及下游基因需要有很强的背景和实验实力才行。

附件

2013-6-4 15:52

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kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

差异蛋白质的丰度很低，这也就对我们的研究方法的改进提出了新的要求。
BIO-RAD有一个液相等电聚焦仪（MICROROTOFOR），浓缩蛋白1000倍以上，在进行2D。

Ao7[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
前列腺癌乳腺癌膀胱肿瘤白血病
　蛋白芯片可以弥补双向电泳捕获不到低丰度蛋白这样的缺陷。以下是我拷贝的关于液体蛋白芯片的资料！供大家分析研究！

液体芯片-飞行时间质谱技术利用磁珠俘获肿瘤患者与健康对照体液中低丰度特异蛋白或多肽，经飞行时间质谱测定和软件分析，建立由两者差异表达蛋白或多肽组成的质谱图模型，用于预测未知样品的归属。
　　它的优点在于：1、俘获的低丰度蛋白或多肽种类多，保证了系统的特异性。在仅一滴血清（10-50μL）中，在分子量范围为0.8-15kDa内，可检测出400多个不同的峰；
　　2、磁珠种类多，有多达十几种磁珠，适用于不同的疾病和蛋白；
　　3、操作简单快捷；
　　4、纳米磁珠巨大的表面积使蛋白的俘获具有良好的重复性；
　　5、样品处理通量高，每天可处理多达3万个样品；
　　6、消耗品价格低，只有同类产品价格的一半左右；
　　7、质谱系统拥有多项专利技术，TOF可检测出含量低至1fmol的蛋白，并可对高丰度的蛋白或多肽进行直接鉴定。
　　在哈佛大学女子医院、纽约斯隆-凯特琳癌症研究所、麻省总医院、贝勒医学院等世界一流医院和医学研究所中，该技术已广泛应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈鳞癌、膀胱癌等的早期诊断研究中。其中在德国，该技术已应用于临床急性淋巴白血病的辅助诊断。综上所述，液体芯片飞行时间质谱技术具有良好的特异性和灵敏度、高通量、操作简单快捷和重复性好等优点，是极具潜力的临床肿瘤早期诊断工具。

Ao7[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但是发现了差异蛋白后，怎么去和基因相关联，确实很难！

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

针对寻找低丰度的差异蛋白难的问题，两位战友都各自提到了一种方法，目前文献中所采取的寻找差异蛋白的途径不外乎以下几种：

1. 亚细胞组分分离，也就是把我们所关注的目标从细胞级放到更小的亚细胞级上，因为一个好的样本因该做到高度的相关性（也就是和你的目标疾病或者基因关联程度，能直接做癌旁就一定不做血浆）同时尽可能的减少复杂程度。比如关注膜上受体和通道的可以单独把细胞膜分离出来，关注发育和进化过程中的差异蛋白质组学的可以单独纯化细胞核等等。

2. 蛋白质预分级，yuyanjun1975战友所提到的BIO-RAD公司的ROTORFOR就是其中的一种，其实它就像一个通过PI来对你的样本进行预分离的色谱一样，而近年因为大家所研究的对象的蛋白质含量逐渐微量话，原来的ROTORFOR的30-60ml的初始样本处理体积实在是强人所难，于是相继出现了18ml的MiniRotofor和2.5ml的MicroRotofor， MicroRotofor虽然只能分出10个组分，但是也能对低丰度蛋白质大为浓缩了。

3. 高丰度蛋白质的去除，这个在血清差异蛋白质组学研究中几乎是必须的，因为前面我们提到了22种已知蛋白质占了99%！而我们真正要找的差异蛋白质却在那仅余的1%里面。但是由于蛋白质相互作用的存在，所以我们在去除高丰度蛋白的同时，也会丢失很多低丰度蛋白，所以在上海生化所的曾嵘老师实验室的一篇MCP文章中我们看到的是他们用去高丰度蛋白的柱子去除了高丰度蛋白，但是保留下来，和低丰度蛋白一起做，把2部分的结果都整合起来，目的也就是不要丢失我们的可能的目的蛋白。

4. 发展新技术，这个就很多了，比如楼上战友战友提到的蛋白质芯片技术， SILAC（Stable isotope labeling with amino acids in cell culture），ICPL， O16/O18，以及很多非标定量的方法。目前的很多改进都是基于质谱技术的进步来发展的，见附图的一个对于蛋白质分离的技术路线的比较。（见下图)

诚然，技术手段的进步可以推动我们的差异蛋白质组学的研究进一步发展，但是实验设计同样的重要，目前国内的蛋白质组学实验室的条件并不差，甚至很多比国外一些实验室都好，但是所出的成果的意义和独创性确差很多，这里我想引用我的导师对我们说过的一句话来表明下我的观点：
"对于蛋白质组学研究而言，最重要的是做什么，其次才是怎么做，即最重要的是要解决的科学问题的存在性及其价值与意义,其次才是技术路线问题。"

样品准备过程我们可能要注意到的东西有以下几点，

1. 选择最简单的样本；
2. 选择最简单的流程；
3. 如果你研究的是低丰度蛋白，使用富集或者去高丰度；
4. 可以先用预试验来判断生物学意义；（从而确定试验我们还有没有必要继续）
5. 必须有充足的和合理的样本数来消除样本的个体差异；
6. 使用与我们研究的样本同样的环境和生物学背景的对照。

选择和制备了好的样本，我们的试验也就成功了50%，祝愿大家在差异蛋白质组学领域走的更远！

附件

2013-6-4 15:55

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小中大

讨论到最后，主题有点发散：
一般应用——低丰度差异蛋白的分析——新技术手段——样品细化分析——……
感谢楼上几位战友，非常受用，学习了！

49888[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试想，对一个功能未明确的基因，是否能通过构建转基因亚克隆细胞模型，与对照组细胞进行差异蛋白组学分析，从而得出与该基因连锁作用的上游及下游基因？这种方法或许能在寻找信号转导通路及分子伴侣上有所帮助。
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以前想做这方法实验，查文献时也看到有人用这种方法研究，

只想提醒实际实验的复杂性：
1，外源基因转染的启动子强度不一样，可能影响蛋白表达谱，如常用的CMV启动子，基因表达量可能高于正常细胞表达量，过高表达后，可能产生异常通路激活。

2，转染不同来源的细胞，细胞的状态，等等，也有可能表达谱不一样。

3，即使所有条件一样，有时重复性也没有想象中的好。（可能现在技术进步会好一些）

4，有时有上千个基因受到上调，下调的影响，对结果分析，也比较难。

For example: 经典的c-myc癌基因，属于转录因子，很多人想找出下游引起肿瘤的通路，但现在仍不很清楚。

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-6-4 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但是发现了差异蛋白后，怎么去和基因相关联，确实很难！

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质谱后，得到小的氨基酸序列，通过race吊基因！

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