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标题:【讨论帖】单抗纯化技术讨论

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发表于 2013-6-4 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】单抗纯化技术讨论

本人从事了多年的单抗纯化工作，具有些许经验，想和大家交流体会。
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-6-4 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最终的验证还是要做spike实验是什么意思??, 与"牛IgG一定要做Elsia的，还有其他可能的杂蛋白都要作相应的Elisa，治疗用抗体的纯度都是这么算的" 是一回事吗??/
谢谢!
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IAM007[使用道具]
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发表于 2013-6-4 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
治疗用抗体还有很多因素要考虑。
举例说，基因工程抗体的主要杂质是：宿主细胞蛋白，宿主DNA，内毒素，泄漏的蛋白A等等。
最终产品纯度检测时，SDS-PAGE和HP-SEC是不能少的；除此之外，还要对生产及纯化过程中可能引入的杂质进行分析。比如，你的宿主蛋白的含量，假设用CHO细胞表达，就要做CHO细胞蛋白的Elisa，如果有血清培养，还要做BSA/牛IgG的检测，一般也是用Elisa，这样得到的杂蛋白的量，再和目的抗体的量算出抗体的纯度是多少，一般杂质要控制在几个ppm以内。
以上述为目标开发出有效的纯化工艺后，还要验证整个工艺的有效性。
一般就要scale-down, 然后加入杂质，再纯化，在此过程中说明杂质和目的蛋白有有效的分离，还要说明每一步去除杂质的能力。
只有spike试验成功，且最终的产品符合所有的质检要求，这样的产品才是合格的。
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发表于 2013-6-4 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教楼主，人IgG2是否会形成二聚体或多聚体，如何避免二聚体或多聚体的形成？另外，在加热过程中，人IgG2的链间二硫键是否会发生部分断裂，在非还原电泳中表现出裂解单链的条带？
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发表于 2013-6-4 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我遇到过非还原电泳煮的过程中产生抗体片段的情况，不过我也不知道FDA对抗体片断含量是怎么要求的。
对于聚集体，好像治疗用抗体质量要求：SDS-PAGE不能超过10%， HPLC也不能超过10%

非还原电泳如果还能看到聚集，应该是共价聚集，我觉得可以通过WB验证不是杂蛋白，不知道报批的过程中会不会要求得更严。上10ug的话，10%也是很粗的带了。

疏水聚集可能通过加点甘油，去垢剂之类的可以避免或减少；共价聚集不好办，加还原剂的话容易把单体的二硫键也打开，不好控制。

有文献可以用IEX/HIC去除聚集体，不过也没说聚集的类型。

就我做过的，有的抗体聚集体可以通过离子交换成功去掉，有的确实不好除，因为带电性质/疏水性质都太接近，分离度有限。除非牺牲收率。
凝胶过滤不好放大，不大想用。
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发表于 2013-6-4 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这样得到的杂蛋白的量，再和目的抗体的量算出抗体的纯度是多少，一般杂质要控制在几个ppm以内。

==========================================================================================================

对这句话有点疑问：主任的意思是不是“抗体纯度的计算值等于抗体量除以抗体和杂蛋白的总量”？
其实，实际的质量检定工作中的，目的蛋白的纯度就是用SDS-PAGE和HPLC分别测定，直接给出纯度数值。由于这两种技术都存在灵敏度的问题和人为因素干扰的问题，所以设定鉴定项目时，得再用ELISA(或斑点杂交)从另一个角度更精确地确证宿主蛋白（培养基蛋白）和宿主DNA微量的残留。
治疗性抗体的质控指标我不熟习，到是做过一些其它的重组蛋白。目前，一般的重组蛋白制剂的纯度指标是95%（或98%）以上，而残留宿主蛋白和宿主DNA的质控指标是0.1%和每制剂包装10pg以下。
对于治疗性抗体，我们国家还没有成品制剂上市。但是质控指标确定的原则是，残留的杂质不会对人体造成可能的伤害。所以不同的蛋白制剂的标准应该不是一样的。比如阿尔法干扰素，100万单位的制剂中只有8微克蛋白，理论上即使存在5%（0.4微克）的细菌杂蛋白，对人体的影响也很小；又比如erb2抗体herceptin，制剂包装有40毫克的规格，1%的杂质就是400微克。
治疗性抗体的剂量都很大。我们国家在治疗性工程抗体上久无进展，差距不仅在于高表达技术和细胞培养技术，纯化和质控也差距很大。其实这些差距也反映在其它的几种大剂量蛋白药物上，比如50mg一个制剂包装的tPA，20年了没有仿制成功；rPA倒是很多厂家拿了批文，可竟有厂家生产不出产品；前几年炒得热闹的endostatin，美国entremed公司的未上市制剂为40mg包装，我们厂家上报的只有2-5mg的规格。

不妥的地方，请小白龙主任指正。再，年龄大了，啰嗦了一些题外的话。
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发表于 2013-6-4 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
治疗用抗体一般也要100mg/dose，如果活性不太好的话甚至需要更多。
所以这也是纯化的重大挑战。百泰的单抗制剂包装是100mg/dose的。
就您说的剂量较大的蛋白药物，但从电泳一条带，HPLC一个峰还不能满足要求，必须对可能的杂质进行定量，针对杂质制定严格的指控标准。我们说的意思其实是一样的。如果要给出较准确地纯度数据，就只能这么计算一下，根据电泳和HPLC我觉得只能说纯度大于90或95%，或未见杂带吧，不能说纯度就是多少。

我翻生物制品规程上面也确实没有像样的单抗的质量标准。
据我理解，主要控制就是：蛋白A，宿主蛋白，核酸，内毒素，当然对聚集体也有一定的要求。

希望多多交流，多多指正！
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woshiduiyan[使用道具]
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发表于 2013-6-4 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在进行单抗纯化，对此还是新手，有很多疑惑，那我想问问有没有这方面的文章可供参考，我是指对纯度方面，谢谢
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-6-4 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好！由于最近工作特别忙，很长时间没有到这里来了，连我的密码都过期了，费了一些周折才上来，大家的帖子挺好的，没能及时回复，实在抱歉！
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-6-4 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
根据我的经验，以及对药检所的咨询，到目前重组抗体确实还没有成型的检定规定，但是如果公司有项目需要申报，药检所会和您讨论适合您的检定程序，一般会参照鼠单抗和基因工程蛋白药物的检定规程。
一般抗体药物的纯度要求是95％，还原电泳（两条带，扫描纯度大于95％，上样量10ug，考染肉眼基本上看不到杂带）＋HPLC检定，非还原电泳作为参照，必须连续三批电泳结果一致，也就是说样品本身对比。
聚合物含量是不超过10％，在国外有公司用Superdex200除多聚体，另外在制剂的时候，一般会加入Tween80之内的去污剂，防止蛋白的聚合。尤其有的公司可能考虑较长的保存期，会采用冻干抗体，冻干过程除了防止失活外，也得防止聚合。
其它的检定标准很多是参照重组蛋白标准，如内毒素、DNA、宿主细胞残留蛋白等，都会规定相应的检定标准并控制在一定的范围内。
谢谢！
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