【讨论帖】喷血推荐blue sliver胶体考染法

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标题:【讨论帖】喷血推荐blue sliver胶体考染法

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发表于 2013-6-4 17:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

喷血推荐blue sliver胶体考染法！

我做了2D的三块平行胶，一个一般考染，一个blue sliver，一个银染（如图从左到右），
我想不用我多解释什么了吧？！！

愿意喷血向大家汇报这种染色方法的初步尝试结果和经验！！

一、先讲讲本版对这种染色方法的提出和进一步讨论过程：
1、站友在“请教：2DE考染的困惑”
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1253068&sty=1&tpg=2&age=0')
中提出银染灵敏度高，但质谱鉴定成功率低；而考染质谱鉴定成功率高，但灵敏度不够；好多地方只接受考染标本质谱。
这也是所有做2D――质谱人的困惑，一些更有意义的蛋白质往往是一些低丰度蛋白质，做分析型2D的银染，发现一些低丰度蛋白质，可是做制备型考染时往往灵敏度不够，检测不到。
之后，他首先提到“electrophoresis杂志2004年25卷1237页的方法，戏称blue silver！”；然后他，为我们提供了全文。可是全文只给了配方并没有给出详细步骤。
他通过给作者写信，最终确定步骤为：
fix : 40 % ethanol + 10 % acetic acid 30min;

wash: distilled water 15min * 4change;

staining: (0.12% CBB G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) overnight
destain: distilled water

之后，他另开新贴，
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1333143&sty=1&tpg=1&age=0')
翻译提供了具体染液配制方法，他尝试了SDS PAGE胶的这种染色方法，于是我就心动了！！也想象原文一样做三块2D胶，试一把。

二、步骤：
原文的步骤见他的下面回帖（热心同志，主任加分呀！），另外为什么用G250不用他也为大家说明了。

1、染液配制：染色液的成份（0.12% G-250, 10%（NH4）2SO4，10% H3PO4，20%甲醇）

100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g 粉末状（NH4）2SO4（边搅拌，边加）先溶解,然后加入 1.2g G-250 再溶解（其实不能真正溶解），用水定容到800ml ，边搅拌边加入200ml甲醇，终体积1000ml（可保存至少半年）。

2、染色
固定: 40 % 甲醇 + 10 % 乙酸 30min或过夜;

水洗: 去离子水 15min × 4;

染色: (0.12% G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) 过夜

3、脱色: 去离子水至背景清楚

三、经验和体会
1、  关于试剂，我用的G250是fisher原装的，硫酸氨是国产的（没时间买进口的，建议大家用进口的），磷酸、醇是国产分析纯（85％），
2、  关于配液
（NH4）2SO4要边搅拌，边加，否则容易结成大块而且很硬很难溶，就这样也不能完全溶解，好像液体已经饱和了。
G250好像在开始加到硫酸氨溶液时也不能真正溶解，只是形成混悬状态。
到最后加入甲醇之后还要搅拌好久，才可以部分真正溶解。
3、  关于改进之处：
我把甲醇改成乙醇，发现好多考染方法用乙醇替代甲醇，另外我的硫酸氨用的国产的，来不及买进口的，估计进口的效果会更好。国产的好难溶。
4、发现脱色有点难，脱干净背景用水要换5、6次，1。5到2个小时。好像背景还有些发蓝，不能真正脱干净。

5、灵敏度确实有很大提高，不过是否真的能够达到ng级就不知道了。

四、关于后续的酶切（原文）：

The gel discs containing the protein of interest were washed twice with 50% ACN ＋ 50% ammonium bicarbonate (5 mM solution)，for a minimum of 2–3 h untill full decoloration of the gel. After that, wash twice (10 min each time) in 100% ACN. In-gel digestion was carried out in 100 mM ammonium bicarbonate, 1 mM CaCl2 pH 8.9, 30% ACN, and 12.5 ng/mL (1 mg) sequencing grade modified trypsin (Promega, Madison, WI, USA) overnight at 37 C.

五、存在的问题：
1、为什么要先用一部分水溶解硫酸氨和R250，之后再加水和醇？而不是一起加，尤其是水，发现100ml水溶100g硫酸氨好难，多加点水可不可以？

2、用乙醇代替甲醇在这种方法里到底合适不合适？？谁有兴趣比较一下？

3、我是拿分析纯85％的磷酸当100％的来配液体的，这样对不对？是否换算之后再配（那样水会加的更少，硫酸氨更难溶）？好像没有纯磷酸，最高85％。

4、  关于脱色遇到的问题，大家有什么实践经验或者高见？？

5、siashq大侠也做了三种方法的比较，还有谁做过？或者将来做了，欢迎大家交流经验、讨论下去。

(注：附原文）

[ 本帖最后由 NBA 于 2013-6-4 17:33 编辑 ]

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2013-6-4 17:33

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发表于 2013-6-4 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看看我的结果：

一个一般考染（上样量1mg），一个blue sliver（上样量1mg），一个银染（上样量0.1mg）（如图从左到右），

附件

2013-6-4 17:35

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发表于 2013-6-4 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie　G-250 staining for proteome analysis一文中有较详细的描述，还有原理的阐述，挺不错的，强力推荐，本版曾讨论过，对蛋白质组研究是一大改进啊！

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发表于 2013-6-4 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其主要区别于经典考染之处是：
１／染料浓度由0.1%加大至0.12%；
２／磷酸浓度由2%加大至10%

第一小时便可吸收80％的染料，而经典考染只有40％，故速度也有所加快，在24小时可达最大灵敏度．

至于用Ｇ-250的原因我觉得主要是：
Fazekas de St. Groth , have always enjoyed a widespread popularity, due to their ease of use and reasonable sensitivity (ca. 0.5 mg/mm2). One mg protein can bind
0.17 mg of Amido black, 0.23 mg of Fast Green, 1.2 mg of Coomassie Blue R-250 (R = reddish hue) and 1.4 mg of Coomassie Blue G-250 (G = greenish hue)

如果大家需要的话我可以贴出此全文．

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发表于 2013-6-4 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主能否把配染料溶液方法详细过程即注意事项贴一下，看paper原文中的过程总觉得不是很清楚。
谢谢！

wsll[使用道具]
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发表于 2013-6-4 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主能否介绍你的实践中的步骤和经验？
我最近会每天做两块这种染色方法，急需大家的交流和指教！
先谢谢大家！

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发表于 2013-6-4 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

五、存在的问题：
1、为什么要先用一部分水溶解硫酸氨和R250，之后再加水和醇？而不是一起加，尤其是水，发现100ml水溶100g硫酸氨好难，多加点水可不可以？
2、用乙醇代替甲醇在这种方法里到底合适不合适？？谁有兴趣比较一下？
3、我是拿分析纯85％的磷酸当100％的来配液体的，这样对不对？是否换算之后再配（那样水会加的更少，硫酸氨更难溶）？好像没有纯磷酸，最高85％。
4、关于脱色遇到的问题，大家有什么实践经验或者高见？？
5、siashq大侠也做了三种方法的比较，还有谁做过？或者将来做了，欢迎大家交流经验、讨论下去.

回答：
１　硫酸氨的溶解度很大，在20溶解度为75.3克/100毫升,80度时为95.3克/100毫升,100度时为103克/100毫升,故在常温下单纯100毫升水很难能溶解100克的,溶液早已呈饱和状态;而加入100毫升磷酸会不会帮助硫酸氨的溶解就不得而知了,既然原文中两次提到"hen the ammonium sulfate has dissolved, add enough Coomassie Blue G-250"和"When all olids have dissolved,add water to 80% of the final volume"那必有他的原因,文中是将硫酸氨加入水和磷酸混合液中,楼主可以试试这样缓慢加入会不会有助于溶解,大家关注这种方法的话也可以试试嘛

2 乙醇应该可以替代甲醇的,但究竟这个替代对灵敏度会不会有影响就不清楚了;

3 磷酸偶觉得还是85%就当85%用,"the desired amount of phosphoric acid is added, so that, in the final volume, its concentration ill be 10%"在终体积下浓度为10%,既然本法的关键所在便是提高磷酸的浓度,那"分析纯85％的磷酸当100％的来配液体"势必达不到最佳的浓度,所以我觉得楼主的染色灵敏度还可以再提高些些;

4 似乎伴随着灵敏度的升高都会带来背景染色的问题,这也是在情理之中的,该法虽然次数多但总算是能脱到比较理想,比起银染的背景还是能让人快慰的;

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小中大

fix那步到底用甲醇好还是乙醇好呢？

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发表于 2013-6-4 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我找到一个protocol（cuturl('http://www.proteomics.missouri.edu/')）又有点不同：
Colloidal Coomassie Brilliant Blue (G-250) – slightly better sensitivity than R-250 and is compatible with mass spectrometric analysis.

1.  Wash SDS from gel with three consecutive washes (10 min each) in MilliQ water. Longer washes may be necessary for 18 and 24 cm gels. It is critical to remove residual SDS from gel prior to staining.
2.  Add enough Colloidal Coomassie stain (20% ethanol, 1.6% phosphoric acid, 8% ammonium sulfate, 0.08% Coomassie Brilliant Blue G-250) to cover gel.
3.  Incubate at room temperature on rotary agitator for at least six hours.
4.  Decant stain and rinse gel twice with MilliQ water (1 min each).
5.  Destain gel with MilliQ water until background is low (4 hours).

第一步不是固定而是水洗去除SDS。而且没有固定步骤

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发表于 2013-6-4 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢楼主！
请教你的上样量？

从siashq 上样量来看，blue silver与考染一样，也用1mg，显色效果提高，
但是与银染间的比较呢？
electrophoresis那篇文章提到的上样量好像没有这么高？好像都是0.1mg

谢谢！

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