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标题:【求助】Western转膜为什么老转不上？

avi317[使用道具]
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发表于 2013-6-5 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western转膜为什么老转不上？


在作Western blot时遇到一些问题，希望得到帮助：

我要作的是90KD的蛋白，我的电泳条件为：用的是Bio-Rad的电泳槽：电泳条件为：浓缩胶（稳压）：80v,分离胶：120V;电泳后用考马斯亮蓝染色，可见Marker和目的带；同一胶的另一半转膜的条件为250mA,2.5h,转膜后丽春红染色什么都没有，连Marker都不见，

我想问的是： 90KD的蛋白转膜的条件到底要为多少：有的说300mA,1h；我也试过，不行？

请高手指点！
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966735obeng[使用道具]
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发表于 2013-6-5 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

按你说的条件，转膜应该没有问题，你要检查一下
1、要保证转膜三明治的顺序，膜和胶放反了肯定不行
2、膜要用甲醇活化
3、转膜过程要保证在低温下4度进行
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-6-5 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
膜放正极，胶放负极，2、膜用100％甲醇浸泡了2分钟，
3、转膜过程要保证在低温下4度进行 （放的有冰袋）

好像都注意到了，丽春红染色什么都没有啊！
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发表于 2013-6-5 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵！这个问题其实很好解决
你找点预览marker一起转一下就知道了！
这样所有可能的问题都会发现！
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发表于 2013-6-5 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看一下胶内是否有蛋白.以此判断是否有效转,另外,NC和PVDF是操作有些不同的
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any333[使用道具]
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发表于 2013-6-5 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议膜和胶的外面多加几层滤纸，使得两者之间紧密接触。另外可以对另一半胶再用染色液鉴定一下残留蛋白质的多少来优化转膜时间。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-6-5 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

丽春红染色液(Ponceau S Staining Solution)可以用于PVDF膜、硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)和醋酸纤维素膜 (cellulose 性acetate membrane)上的蛋白的检测。丽春红染色液不适用于尼龙膜上的蛋白的检测。你确信你的是不是尼龙膜?
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发表于 2013-6-5 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有几个需要注意的问题：
1.蛋白分子量< 10KD
2.蛋白的等电点< 9
3.SDS浓度不合适
4.凝胶太厚
解决的办法：
1.蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜
2.更换高pH值Buffer
3.在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率
4.延长转膜时间
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zzzz[使用道具]
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发表于 2013-6-5 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你用的是湿转还是干转？我做过干转，用的是北京六一仪器厂的半干式炭转移槽，转膜条件是跑恒流，电泳毫安数由膜的表面积(平方厘米)乘以二来确定。电压放开，一般就在10v左右，用时1.5～2个小时，转的效果挺好的。另外，也得考虑膜和胶的大小，两者要大小一致，防止电流短路，使得转膜效果不佳。转完之后，最好将胶再作染色，看看转的是否彻底。
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avi317[使用道具]
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 小中大
我的是湿转！用的确定是PVDF膜，转的时候也用Marker啦，可连Marker都看不见！而在电泳后用考马斯亮蓝染色后，Marker条带和目的蛋白的条带看得到，可就是转了以后什么都没有！曾经有一次转出来可见到条带，可现在什么都没看见！
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