蛋白质与蛋白组学

Q1可不可以分次孵育不同的一抗？Q2抗体能不能分装？因为我怕多次冻融抗体失活，但是我老板说量太少了不 ...

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Q1的意思是先用种一抗孵育tbst洗三次再用另一种一抗孵育一次。
Q5 我是一直做不出磷酸化的蛋白，加了抑制剂，连总蛋白也没了，好怪。

1. 一般是先测一种蛋白，然后洗掉膜上的抗体然后重新上另一种一抗。也有人会把两种一抗混合在一起孵育，我试过效果还可以但是这样抗体没办法回收
2. 一般都是分装的，不过如果量很小而且所有实验都在3个月内完成的话不分装直接放4C也可以
3. 牛奶建议不要冻，一抗怕染菌的话加一点叠氮钠可以放很久（二抗万万不能加）
4. 没有经验，希望其他人说明
5. 不要用奶粉封闭，里面自带大量磷酸化蛋白

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谢谢前辈。
请问叠氮钠需要加多少量呢？
另外请问前辈，不用奶粉封闭是不是直接加用TBST的一抗孵育？不需要先牛奶封闭1小时+一抗孵育过夜？因为我的一抗是用加在5%脱脂奶里面的。

哇！谢谢前辈！
我用的是pierce 的Restore Western Blot Stripping Buffer。

Wash blot to remove chemiluminescent substrate
Incubate blot in Restore Western Blot Stripping Buffer for 5 to 15 minutes at room temperature
(or incubate at 37°C for high-affinity antibodies)
Remove blot and wash in Wash Buffer
Block membrane
Test for sufficient removal of antibodies
Perform next immunoblot experiment

and stripping的效果非常不稳定，试过三次，都是十分钟，室温，第一次洗到一抗再也孵不上，第二次刚刚好，第三次洗不够。晕死了。我是这样做测试的洗完之后显色液/二抗-显色液/一抗-二抗-显色液，分别看二抗、一抗、抗原的情况。第一次是摇床， 第二第三次是刷羊肉一样洗。

[ 本帖最后由 zhezhe 于 2013-6-5 15:34 编辑 ]

谢谢前辈。
请问叠氮钠需要加多少量呢？
另外请问前辈，不用奶粉封闭是不是直接加用TBST的一抗孵育？不需要先牛奶封闭1小时+一抗孵育过夜？因为我的一抗是用加在5%脱脂奶里面的。

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叠氮钠一般加0.02%就可以了，一抗有叠氮钠的情况下洗膜时间要加倍，防止残留的NaN3导致二抗失活
奶粉里有磷酸化蛋白（主要是磷酸酪氨酸）和磷酸酶, 前者会提高背景，后者会减弱原本的信号，所以不要用
可以试试5%BSA封闭1小时后用TBST冲一下，加一抗过夜

Q1的意思是先用种一抗孵育tbst洗三次再用另一种一抗孵育一次。
Q5 我是一直做不出磷酸化的蛋白，加了抑制剂，连总蛋白也没了，好怪。

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没有这样做过，因为抗体/封闭之间是一个竞争的关系，时间长了估计原本的信号也没了。一般为了求快也就是剪膜或者两种一抗同时孵育。最稳妥的方式还是Strip后重新上一抗

pierce的3432洗脱液？你看看MSDS就知道成分是酸性甘氨酸+TCEP，洗不干净是正常的。大部份文献里做wb用的洗脱液是2% SDS，55度孵育。可以洗得很干净但是抗原损失较多

我常用的的PVDF抗体洗脱液配方是
6M 盐酸胍
0.2% tween20
50mM tris ph 7.5
用之前加硫代乙醇到100mM，室温摇床洗15分钟。洗的时候膜会变透明。TBST洗三次到没有硫磺味道为止就可以了

我用的是pierce的21059的洗脱液，成分查不到。
按前辈的配方就是下面这样配成100ml？
95.53*6/10=57.318g 盐酸胍
200ul tween-20
121.14*50/1000=6.057g Tris
62.13/13*0.1=0.247m l硫代乙醇

现在我改用5%BSA+TBST的blocking buffer和一抗，pH值应该在10.0左右。
那我想问洗脱液需要pH7.5吗？因为我看别人的pH有很多种。