蛋白质与蛋白组学

换一下载体看看

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谢谢，载体是经过挑选的，算是还比较好做的了

1.仔细检查下序列，是不是移码等原因导致起始或终止密码子没有了。一般大肠杆菌多多少少能表达点东西出来的，但如果基因的结构不完整就是另外一回事了。
2.如果有稀有密码子，都替换掉。
3.诱导加抗生素没有？是不是表达的过程中质粒丢失非常严重？可铺抗性和非抗性平板检测一下。

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谢谢
1.测序结果我们仔细对比了一下，900多bp的序列只错了4个，也没出现终止密码或者是稀有密码呢。
2. 都加了抗生素，我用空质粒摇菌做了对照，GST的蛋白有表达，但是重组蛋白却怎么也出不来。
3.我之前做的都是25°诱导3h，结果提不出重组蛋白；后来查到文献，用20°诱导过夜后提出的蛋白却是GST，我想请问一下，这可以说明我的目的蛋白没表达吗？
非常感谢！

是不是目标蛋白有毒性？ 可能导致表达量过低 可以用检测下
也可以换对毒性蛋白有耐受性的菌株 C43(DE3)
稀有密码子 可以换用rosette菌株

是不是形成包涵体了？

。。。

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谢谢
1.目的蛋白没有毒性，纯化后做western看不到目的条带，
2.包涵体我也做过，没有结果，查了很多文献，我的目的蛋白还是可溶性的，我想就算形成包涵体，上清里应该还是会有一定量存在的，western应该可以检测出来的吧，到目前为止还是什么结果都没有。

呵呵，表达不出来是很正常的。
我之前做的一个蛋白，换了N多个载体，摸索了N多诱导条件，结果还是不表达。
后来我就把这个基因送去公司优化了一下，进行全基因合成。结果还是不表达，同样摸索了N多条件，都不表达。
而且有两个有意思的现象，当我把它连在GST后面融合表达的时候，没有明显表达，于是我用GST柱纯化了一下，发现结合的只有GST。
然后把它连接到NusA这个蛋白后面融合表达，结果诱导出来的是一个比NusA小很多的蛋白，表达量很高。
最后我把这个蛋白接在MBP后面融合表达，37度诱导，发现有少量的表达。20度诱导有大量表达。这些充分说明，蛋白表达与否跟其RNA的二级结构以及稳定性有相当大的关系，不可不察！

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谢谢

那是不是说融合蛋白的表达与否及量的多少与标签蛋白有关呢？

还有我最近有查到有文献已经做出了这个融合蛋白，可无赖我怎么改变条件就是提不出来啊...还在找原因呢