【求助】好奇怪的条带

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标题:【求助】好奇怪的条带

utt0989[使用道具]
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发表于 2013-6-5 17:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做瘦素（16kd）的蛋白western，因为之前没有任何条带，怀疑是样品问题，所以这次加了标准品，结果出现了非常清晰的条带，但奇怪的是条带不在16kd附近，却在160kd处甚至更大，真的好奇怪啊！
各位战友，或有哪位做过瘦素的，能指点一下吗？感激不尽！

newway[使用道具]
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发表于 2013-6-5 17:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

指的是标准品瘦素出现在160KD吗？
是不是在变性的时候形成了多聚体？没有跑下来？
为了验证，用western的变性上样缓冲液与非变性缓冲液溶解样品，跑一个小的琼脂糖柱过滤一下，看看流下来的速度。
另外，瘦素的PI是否偏碱？电泳时难于向负极跑？

utt0989[使用道具]
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发表于 2013-6-5 17:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上的回复！
如果是变性时形成了多聚体，那该如何处理呢？
我的loadding buffer配方是50mM Tris-Cl（PH6.8）,2%SDS，0.1%溴分兰，10%甘油，5%巯基乙醇。与分子克隆不同的是用5%巯基乙醇代替了100mM DTT，难道这点就是导致失败的原因吗？明天换成DTT试一下

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发表于 2013-6-5 17:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品加热变性是否充分？

小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2013-6-5 18:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也做WB,不是和你一样的蛋白,但是也和你一样,出现一个很特异性条带,而且只有一个条带,信号很强,却在我的目标条带所在的位置上面,我也不知道什么原因.你有什么见解请告诉以下吧!谢谢

8s5g[使用道具]
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发表于 2013-6-5 18:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也出现类似问题：磷酸化蛋白(50kd),却在70kd或100KD附近检测到非常特异的条带！

★★特此请教：

1）您提到目标蛋白的PI是否偏碱？我目标蛋白pI=9,难道这样的蛋白质在电泳过程中难于向负极跑？甚至向正极(相反方向)移动？有没有必要将电泳液的PH提高到大于该蛋白质的pI??
2）这种高pI的碱性蛋白质，在转膜的时候是否跟其他pI<8.6的蛋白不一样？是否需要将转膜液PH提高到大于9.0?

非常感谢！！

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发表于 2013-6-5 18:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我提的蛋白并不偏碱
碱性蛋白在跑变性电泳时并不会向正极跑，但会电泳比较慢，所以会显得得到的分子量较大。
SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质 -SDS 复合物。在一定条件下， SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4 SDS/1g 蛋白质。
并且碱性蛋白转膜不能用Tris-甲醇体系，而要用Tris-SDS体系。

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发表于 2013-6-5 18:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问Tris－SDS体系，具体是什么配方？（我在网上也看到，说要用Tris-SDS体系，但不知道具体是什么组成）。

谢谢！

966735obeng[使用道具]
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发表于 2013-6-5 18:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

给一个配方
转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

9900[使用道具]
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发表于 2013-6-5 18:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也有类似的问题，目的条带95KD，但WB特异的条带在170KD以上，无法解释？？

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