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标题:【求助】请教关于非还原性蛋白WB的问题

am10[使用道具]
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发表于 2013-6-8 08:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教关于非还原性蛋白WB的问题

各位大侠，小弟新近做WB，文献里写道蛋白处理是“Gel Running Conditions: Non-reduced Denaturing”，请问是否这就是“非还原性蛋白”？此种蛋白是否只是在样品处理时不加还原剂（如DTT或2-巯基乙醇等）即可？而仍需沸睡煮3~5分钟变性？
Non-reduced Denaturing与非变性蛋白（"Native"）不一样吧？
小弟第一次做的时候按常规处理，结果条带非常淡，而内参条带显色很好。
真诚希望大家的帮助！急！谢谢！
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二丫头466[使用道具]
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发表于 2013-6-8 08:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两者不一样。
Non-reduced Denaturing：非还原变性，除了上样缓冲液中无还原剂外，其余等同通常的SDS-PAGE。
Native：非变性。天然状态下上样，无SDS,无还原剂，不煮样品。
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发表于 2013-6-8 08:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

小弟近日做一种分子量较大的蛋白（包含280/120KD 2个片段），文献提示为非还原变性，上样量为80ug，我尝试了6%及8%的胶，电转60V 2.5h，快速封闭液0.5h，1抗(1:300)4度过夜，2抗(1:2000)1h。做了好几次都没有任何条带，而内参显示挺好的。不知各位大侠能否指导下，是否存在什么错误或不足？？？
PS：此外我用的Fermatas SM1841蛋白maker，在10孔1.5mm厚度加样20ul了，电泳后胶上显示挺好，但转膜后条带非常淡，很多还看不出来，这是为何啊？？？
非常感谢！
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linlinstar[使用道具]
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发表于 2013-6-8 08:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 二丫头466 于 2013-6-8 08:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
两者不一样。
Non-reduced Denaturing：非还原变性，除了上样缓冲液中无还原剂外，其余等同通常的SDS-PAGE。
Native：非变性。天然状态下上样，无SDS,无还原剂，不煮样品。 ...

那样品需要加蛋白抑制剂吗？内参怎么办？
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发表于 2013-6-8 08:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 linlinstar 于 2013-6-8 08:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


那样品需要加蛋白抑制剂吗？内参怎么办？

就是上样缓冲液不加dtt或2-ME，其它都一样，该加什么加什么。
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发表于 2013-6-8 08:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 二丫头466 于 2013-6-8 08:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


就是上样缓冲液不加dtt或2-ME，其它都一样，该加什么加什么。

制胶也不能加SDS是吗，我的是要求天然蛋白、非还原条件。
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发表于 2013-6-8 08:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
制胶也不能加SDS是吗，我的是要求天然蛋白、非还原条件。

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请问这也是要电转，然后二抗，ecl曝光吗？？还是用什么染色的方法啊，好晕。
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发表于 2013-6-8 08:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
制胶也不能加SDS是吗，我的是要求天然蛋白、非还原条件。

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那你的是native胶， 跟他的不一样。
不能加SDS了，你查下native胶的做法就行了。
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二丫头466[使用道具]
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发表于 2013-6-8 08:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问这也是要电转，然后二抗，ecl曝光吗？？还是用什么染色的方法啊，好晕。

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这个是western blot。不是染胶啊。
看你需要怎么做。如果你的蛋白浓度很高，那么把胶用考马斯亮蓝染色就行。
如果你的蛋白量很少，无法用染色方法直接在胶上看到，或者需要用抗体来证实目的条带的特异性，那就带跑western blot， 需要转膜，封闭，一抗，二抗，ecl曝光
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linlinstar[使用道具]
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发表于 2013-6-8 08:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个是western blot。不是染胶啊。
看你需要怎么做。如果你的蛋白浓度很高，那么把胶用考马斯亮蓝染色就行。
如果你的蛋白量很少，无法用染色方法直接在胶上看到，或者需要用抗体来证实目的条带的特异性，那就带跑western blot， 需要转膜，封闭，一抗，二抗，ecl曝光

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呜呜，还好有人回复，谢谢。
因为是native的，平时用的marker应该不行了吧，我看有的说不需要加marker，那么电转后我怎么知道切哪部分呢？
还有一个问题，就是内参怎么办呢，native还是sds，native的话应该需要不用于sds时用的新的内参抗体么？还有这种native的蛋白怎么定量啊，需要吗?
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