【求助】原核表达目的蛋白的一些疑问

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标题:【求助】原核表达目的蛋白的一些疑问

079777chao[使用道具]
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发表于 2013-6-8 10:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小弟我请求赐教！
我用的载体是pET32 ,诱导的蛋白分子量为38kd，目的基因连上pET32后酶切鉴定发现目的条带很弱，但还是继续往下做了，随后用1mM的IPTG30度诱导8小时，SDS-PAGE发现明显目的蛋白没有很明显的条带，不太明白，是不是连上pET32的目的基因太少了呢？还是诱导条件的问题？此外，如果以后诱导成功了，就要纯化此蛋白，老板想要用Ni-NTA法，原理和步骤我都已经查过资料，但是我对亲和层析在操作过程中要注意的要点不太了解，而且对于上柱前的样品准备步骤也不太明白，希望各位能够慷慨赐教，谢谢

abc816[使用道具]
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发表于 2013-6-8 10:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

酶切鉴定时目的条带一般都要淡于载体带，因为带的亮淡是和核苷酸的量有关的，核酸多掺入的EB量就大亮度就高，所以在摩尔数相同的情况下，分子量大的片段就会相应的亮一些。如果测序确定是正确的就是插进去了，和酶切条带的亮弱没有关系，因为你挑的是单克隆提取质粒，所以其中的菌的性质是一致的，即如果菌落PCR和酶切鉴定的结果表明含有重组质粒就每一个菌都含。诱导表达没有明显的表达带是很常见的，SDS-PAGE的分辨率是有限的，表达量小的时候是看不到明确的表达带的，需要用western进一步鉴定，如果是隐性结果才能说没有表达。改变诱导条件是有可能改变表达效果的，你可以从诱导温度、IPTG浓度、起始诱导菌浓度等几个方面进行改进。但也可能你的蛋白就是在这个表达体系中无法表达，需要更换表达载体或表达菌株；如果目的蛋白对细胞的毒性比较大的话，在大肠杆菌中无法表达，可以改用酵母或是哺乳动物细胞进行表达，可能效果比较好。
用Ni-NTA进行纯化比较容易，可以先按照资料上的步骤试一下，对于大多数蛋白来讲是没有问题的。需要注意的是尽量不要选择Tis-Cl缓冲溶液。样品准备步骤你有什么不明的呢？？具体说一说。

079777chao[使用道具]
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发表于 2013-6-8 10:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

关于样品准备步骤，我查阅的资料中说法不一，比如：关于裂解细胞的方法，分子克隆上用1mg/ml的溶菌酶来裂解，这样比较温和，不会造成细胞灾难性裂解；而另一些文献上说用超声波，有的说用反复冻融，我不知哪种方法比较好！还有就是资料上都说，收集蛋白时用1ml分布收集，我对1ml中能容的目标蛋白的量不清楚，每1ml收集一次目标蛋白的浓度会不会太低呢？最后一个问题是，收集完之后，用SDS-PAGE来检测目标蛋白的纯度可行吗，浓度太低的话，胶上会不会看不出来？
再次感谢您对我的帮助！

abc816[使用道具]
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发表于 2013-6-8 10:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在破菌常用的就是超声波，但比较剧烈。添加溶菌酶后还是要超声，只是时间会短一些。依照我的经验，先在破菌缓冲液中加入溶菌酶搅拌半小时，再超声会比较容易，同样的超声时间条件下，加溶菌酶会更加充分。超声对于我做的十几个蛋白都没有什么损伤，我觉得还是具体看你蛋白的情况，如果资金比较多的话加点溶菌酶绝对没有坏处；如果...，你就先用超声试试。
在做线性洗脱时通常需要分布收集。如果你没有紫外检测装置的话，每次收集的量就少些；如果有的话，只要从蛋白峰出现的时候开始收集即可。至于每次收集的具体量，要看你的蛋白表达量和你的洗脱条件。我建议你具体试一下吧。如果是亲和层析，每次接的量很少没有很大意义，这也包括第一步层析，如用离子交换或是疏水去初步分离浓缩目的蛋白。如果是主要的分离步骤，分得就要开一些。至于1ml中的蛋白量跟你的蛋白表达量、层析条件都有关，所以我也不太好说。
利用SDS-PAGE可以初步判断纯度，如可以去做凝胶扫描。但这与你电泳的效果有关。
总之，蛋白纯化要靠经验和运气。

079777chao[使用道具]
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发表于 2013-6-8 10:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

又要麻烦您啦，我仔细看了一下pET32a(+)的载体图，发现在trx和目的蛋白之间有一个histag，在目的蛋白之后也有一个histag。但是目的蛋白之后的histag应该是要在设计引物的时候多加一个碱基才能够表达，如果按照三的倍数设计引物的话，histag就不会表达，而是被很多的Pro取代，那么整个融合蛋白就只有一个histag而且挂在融合蛋白的端部，我想问一下只有一个histag能挂在柱上吗？挂在蛋白的端部会不会有影响？

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发表于 2013-6-8 10:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

正好我也在用pet32 但是是LIC vector. 我表达的时候put stop condon 在我片断的后面。是没有要后面的那个his tag的，中间的his tag是可以挂柱的，至少我的蛋白是这样。不然人家公司的人干吗要把中间也放一个his tag呢？
我也是第一次做。有空可以多交流下。

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发表于 2013-6-8 10:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是希望如果能有两个以上的histag挂柱效率总要比一个histag高吧

abc816[使用道具]
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发表于 2013-6-8 10:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议以后设计表达载体时要仔细研究原载体，否则后续试验出现问题不好分析。
一般情况下His-tag是放在蛋白的N或C末端，因为大多数蛋白的末端是在蛋白的表面，有利于tag和柱子的结合。His-tag多为六个组氨酸，如果能够暴露在蛋白的表面无论它在什么位置都能和柱子结合，四个组氨酸就已经可以和柱子结合了。你利用的His-tag和trx以及目的蛋白之间均有linker序列，可以在某种程度上防止trx和目的蛋白将His包裹在蛋白内部，但具体它到底会不会被包裹，取决于这三个域的相互作用以及缓冲体系的综合效果，这个是很难预测的。
另外His多放在蛋白的C端，因为在N端时可能会影响目的蛋白的表达，但你的情况似乎不是这种情况。

abc816[使用道具]
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发表于 2013-6-8 10:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对不起，我有点看不明白你的蛋白是什么样的序列。有没有用Trx呢？如果用了，参见我上边的回答。如果没用，那你的His就在蛋白的N-端，如果表达了一般挂柱就没有问题；如果没表达就可能是N端的His影响了整个蛋白的表达，建议利用C端His。

079777chao[使用道具]
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发表于 2013-6-8 10:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您说的对，在做之前我确实没有仔细研究载体阿，虚心接受您的建议！！！
再来说一下关于我的融合蛋白的问题吧：我的却是用了trx的，我觉得用不用trx应该是不能选择的吧？因为它是在多克隆位点之前的不是吗？在trx和我的蛋白之间的linker上有个histag这个应该没错吧？

我现在遇到的问题就是由于我的引物设计不当，可能导致C端的那个histag无法表达，这都是由于我自己的粗心造成的阿！

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