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标题:【求助】关于hif-1

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发表于 2013-6-8 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于hif-1


做了两个月的WB，hif-1α还是没有做出来 ，按园子里的前辈方法做了还是没有，也不知道是不是抗体问题，先买了ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ　，后又买了ｎｏｖｕｓ的，所以在这想请教下哪位老师做出来过，并且现在仍有抗体的，能否转卖点给我，因为现在再从国外买几乎是不可能的了……
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发表于 2013-6-8 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现在怎么样？做出来了吗？
我做了几次，也都没出。
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发表于 2013-6-8 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有一次将抗体浓度增加到1：200 隐约看到很弱的条带 （之前用的浓度都是1：500）的 但是没有阳性对照 所以也不确定到底是不是 现在已经放弃了
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发表于 2013-6-8 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请牛人们帮助分析一下 这样条带问题存在哪里？上样？还是转膜不够好？
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发表于 2013-6-8 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在做novus的HIF-1α
我一般是30V过夜转膜16小时，再100V转1小时
一抗1：1000
二抗用的康城的1：5000

你的发光液和显影液都是新的吗？
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发表于 2013-6-8 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是BD Bioscience的，稀释1:1000，一次就出来了。
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发表于 2013-6-8 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
肿瘤
你确信你的蛋白有表达么？
很多情况下，细胞内的hif的mRNA可以很高，但是因为有氧存在下
hif的蛋白很快被降解，所以很多肿瘤细胞在体外培养的时候，WB是杂不出的
如果不是在厌氧培养箱里，一般的要加入适量的氯化钴培养一段时间，会杂出很强的条带的。
其实你也可以这样做个对照啊，用别人已用的细胞系和培养条件，得到细胞总蛋白，或者有纯化的hif蛋白，WB的时候用来做个对照，如果纯化的蛋白都杂不出来，那才是你体系的问题吧。
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发表于 2013-6-8 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢多谢！
我做的是缺氧模型。可是无论组织还是细胞都没有出来过。难道会在提取的过程中都降解了？
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发表于 2013-6-8 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你加氯化钴做个阳性对照吧
你看看抗体说明书上的阳性数据是什么，比如我们用的抗体，说明书上的条带就是Hela细胞用氯化钴处理的蛋白，杂的条带，这样的话就可以看看是你WB的问题还是缺氧体系的问题了。
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发表于 2013-6-8 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

原来有不少园友在做HIF-1 我的课题也是要检测肾脏组织HIF-1的表达情况，看来此指标采用WB是不好做了。。期待有成功的网友能多介绍一些经验。。
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