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标题:【求助】Western 检测HIF-1a蛋白

bongte[使用道具]
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发表于 2013-6-8 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western 检测HIF-1a蛋白

相关疾病：
阿尔茨海默病
各位GGJJ们，本人快被HIF-1a逼疯了！一直想把HIF-1a蛋白给做出来，试了很多办法，都没有成功！
试过常规裂解液提蛋白，没结果。从论坛上看过用2*Loading buffer（不含溴酚蓝）裂解细胞，但发现个问题，就是：大培养皿，细胞数很多，加200ul 2*Loading buffer 后，裂解产物很粘稠，超声细胞仪破碎细胞后 ，4度12000离心10min，发现EP管中没有沉淀，裂解产物变得很透明。（以前用常规裂解液，EP管底部绝对有沉淀）后面无法用BCA法蛋白定量（颜色很深，貌似蛋白浓度很高）。后面煮沸10min，上样电泳，后续常规。重复很多次，就是做不出来啊！！！
求救！！！sos！sos！
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发表于 2013-6-8 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个不能只看样本中蛋白的含量，跟目的蛋白在该细胞中的表达量有关，要是表达比较低要调高一抗的浓度，还有你的内参条带出来没有，
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发表于 2013-6-8 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bongte 于 2013-6-8 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
相关疾病：
阿尔茨海默病
各位GGJJ们，本人快被HIF-1a逼疯了！一直想把HIF-1a蛋白给做出来，试了很多办法，都没有成功！
试过常规裂解液提蛋白，没结果。从论坛上看过用2*Loading buffer（不含溴酚蓝）裂解细胞，但发现个问题，就是：大培养 ...

内参做的怎么样？
HIF-1alpha我们做过啊
很好做
你用哪里的抗体？
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bongte[使用道具]
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发表于 2013-6-8 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复楼上：内参是有的！检测的是HCT116细胞，别人做出来过！抗体用的是CST公司的！
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bongte[使用道具]
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发表于 2013-6-8 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 NBA 于 2013-6-8 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


内参做的怎么样？
HIF-1alpha我们做过啊
很好做
你用哪里的抗体？

请问版主是用常规的提蛋白，及Western方法吗？能否把你们的操作SOP发给我啊！
不甚感激！
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发表于 2013-6-8 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 NBA 于 2013-6-8 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


内参做的怎么样？
HIF-1alpha我们做过啊
很好做
你用哪里的抗体？

请问版主，你是做细胞还是组织的？HIF-1alpha是提总蛋白还是核蛋白呢？用什么方法提的？过程中关于防止HIF-1alpha降解要注意什么呢？希望版主能给指点一下，不胜感激！
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发表于 2013-6-8 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们是提取总蛋白做的
没有碰到大家提到的降解现象啊
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发表于 2013-6-8 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 NBA 于 2013-6-8 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们是提取总蛋白做的
没有碰到大家提到的降解现象啊

请问版主做的是组织吗？提蛋白用RIPA（强）加1%PMSF，在冰上研磨裂解半小时再离心12000r，15min，然后取上清就可以了吗？有人说要把第一次离心的沉淀加RIPA（强）和1%PMSF裂解再离心取上清，才能得到核蛋白。版主具体怎么提蛋白的？有没有离心两次呢？
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发表于 2013-6-8 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 NBA 于 2013-6-8 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


内参做的怎么样？
HIF-1alpha我们做过啊
很好做
你用哪里的抗体？

我也非常想知道HIF-1a 用western blot 做的具体过程和注意事项。
我在提细胞蛋白过程中也遇到了楼主所提的情况，我用的也是RIPA（强）+1%PMSF，研磨后裂解液很粘稠而且15000rpm,10min离心后一点沉淀也没有，但是在吸得过程中会看见很粘稠的物质，这是基因组蛋白吗？还有我用的缺氧培养箱培养的细胞，在培养箱中拿出来后提蛋白，看到文献中说HIF-1a在常氧下会很快降解，不知道我从培养箱拿出来到提蛋白这一过程中会不会对以后的检测产生很大影响呢？
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gogo[使用道具]
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发表于 2013-6-8 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 DONT 于 2013-6-8 11:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


请问版主做的是组织吗？提蛋白用RIPA（强）加1%PMSF，在冰上研磨裂解半小时再离心12000r，15min，然后取上清就可以了吗？有人说要把第一次离心的沉淀加RIPA（强）和1%PMSF裂解再离心取上清，才能得到核蛋白。版主具体怎么提蛋白的？有没 ...

请问楼上不知您的问题解决了没？能不能传授一些经验给我啊？谢谢，谢谢啊！

请问你现在是怎么提蛋白的啊？是提总蛋白还是核蛋白啊？
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