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标题:【求助】蛋白marker跑不出来

ququer787[使用道具]
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发表于 2013-6-8 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白marker跑不出来


大家好，我刚开始做蛋白，遇到些麻烦，希望高手帮忙解决一下，不胜感激！！
我提的是总蛋白，聚丙烯胶用的分离胶12%的，浓缩胶4%的，浓缩胶缓冲液0.5M ph6.8 分离胶缓冲液1.5M ph8.8 电压开始80 后来120 ，marker总是看不到带，其他蛋白也没有几条带，不知道怎么回事！！……
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2013-6-8 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

lia 连MARKER都没有的话。肯定是配制胶有问题啊
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-6-8 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我刚开始做蛋白，遇到些麻烦，希望高手帮忙解决一下，不胜感激！！
我提的是总蛋白，聚丙烯胶用的分离胶12%的，浓缩胶4%的，浓缩胶缓冲液0.5M ph6.8 分离胶缓冲液1.5M ph8.8 电压开始80 后来120 ，marker总是看不到带，其他蛋白也没有几条带，不知道怎么回事！！……

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不会是电极接反了吧？
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-6-8 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一般是用浓缩胶5%的，不过问题不大的，电极一般不大会放反的（我觉得），虽然这是个原因。还有就是电泳液的问题。我3.03g的tris，14.4g的甘氨酸，1gSDS。然后就是你的夹子有没有夹紧，会不会缓冲液漏出来。
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发表于 2013-6-8 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先考虑你制胶所用的试剂是否可靠，或者制胶的时候是不是忘了加什么东西。要排除这个问题很简单，借别人做出过条带的样本，用你自己制的胶跑一遍，如果做不出来，我建议换掉所用的制胶的液体，重新配制；如果能够做出来，就要考虑转膜的条件了；
其次转膜的时间和电压电流的条件。一般恒流200mA,90min.不过有人用恒压，具体多少不清楚，转膜十几分钟就行了，时间稍长就会转过，这样也不会看到marker。
现在有可视marker，在跑胶的过程中就可以看到marker分开成一条一条的，如果电永的过程中都没有看到marker，那就是你制的胶不行。
祝你好运
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ququer787[使用道具]
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发表于 2013-6-8 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的凝胶和缓冲液都重新配过，而且都是按照教科书上的配的，但是还是跑不出marker，电泳液也要换么？我再尝试下！！
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ququer787[使用道具]
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发表于 2013-6-8 12:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是SDS-page，跑的是1.5mm厚的小板凝胶，电压电流合适不呢？

我的电极液的配方是tris 6.0g 甘氨酸 28.8g SDS 1 g定至1000ml ph8.3，，，你说的电极液配方是500ml还是1000ml的呢？

浓缩胶和分离胶缓冲液浓度可不可以一样呢？那个缓冲液的浓度是什么作用呢？
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发表于 2013-6-8 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


10×SDS Running Buffer



Tris-base：30g

Glycine ：144g

SDS ：10g

加水至1000ml，混合均匀，调pH至8.3

第一、我以前是按照这个来的，做的不错，条带很好。把running buffer配成1×的就可以用了；
第二、浓缩胶和分离胶的缓冲液的浓度应该不可以一样。因为，浓缩胶的目的是把样品浓缩成很窄的范围内，其原理是电泳启动时，蛋白样品处于PH6.8 的上层，PH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。出现了PH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Clˉ解离度大，Proˉ解离度居中，甘aaCOOˉ解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Clˉ> Proˉ >—COOˉ。在Clˉ与Proˉ之间和Proˉ与—COO?之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使Pro?向Cl?迁移，—COO?向Pro?迁移。如：一个Cl?领路，—COO?推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。
在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro?受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。
当蛋白质进入分离胶时，此时Pro?，Cl?，甘aa 离子在PH8.8 的溶液中，Cl?完全电离而很快到达正极，甘aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于Pro?在电泳过程中，受到溶液离子的变化而PH 值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。
缓冲液的浓度不同应该是与离子强度有关，这个说实话我也没想明白这个问题，帮不了你。

不过我用的缓冲液和你的是一样的，应该不是缓冲液的问题。最有可能的我还是认为你用的30%丙烯酰胺储存液可能不行。
还有一个办法：让会做的人帮你做一次，排除你的操作上的错误。也可以在网上找相关的视频看看，一般有很详细的操作流程。
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ququer787[使用道具]
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发表于 2013-6-8 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

经过换电泳液的尝试，我的marker终于跑出来了，谢谢楼上的解释和分析，很详尽！！！我刚开始学习跑电泳，什么都不怎么懂，希望大家以后多多帮助！！！
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