蛋白质与蛋白组学

朋友，你说的是把睾丸蛋白与柱上的蛋白分离吧。另一蛋白一点信息都没有啊。

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另一个蛋白是6his蛋白，没有用柱，只是先用BufferA溶解蛋白，然后通过Ni-NTA磁珠吸附6-his蛋白后，再用Wash Buffer洗三次，然后用Elution Buffer 洗脱三次，每次25微升，Wash Buffer的配置：100mM 磷酸二氢钠，10mM Tris Cl;8mM 尿素；pH6.3;
Elution Buffer 与上面配置相同，只是pH调为4.5

大概步骤就是这样弄得，都是按照说明书上一步一步做的，但做了好多次了，每次蛋白都留在BufferA中或Ni-NTA磁珠上，Elution Buffer 就是洗脱不下来，不晓得哪里出问题了，愁死人了

要看是什么类型的结合，一般的洗脱如抗体-抗原结合可以用低pH (50mM甘胺酸，pH2.7), 其他相互作用可以用1-2M尿素, 0.5-2M精氨酸等等

你没说清楚你要做的是什么实验，如果是一般的pull down的话直接用咪唑洗脱所有蛋白不就好了

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我是把一种菌液先用BufferA溶解，将蛋白释放出来，，然后通过Ni-NTA磁珠吸附6-his蛋白后，再用Wash Buffer洗三次，然后用Elution Buffer 洗脱三次，每次25微升，Buffer A：100mM 磷酸二氢钠，10mM Tris Cl，6M盐酸胍；
Wash Buffer的配置：100mM 磷酸二氢钠，10mM Tris Cl; 8mM 尿素；pH6.3;
Elution Buffer 与Wash Buffer配置相同，只是pH调为4.5
每次跑SDS-PAGE胶，发现目的蛋白只在BufferA中或Ni-NTA磁珠上（Ni-NTA磁珠最后加水，也跑一个泳道），Elution Buffer 液里就是木有，不晓得怎么回事呢

大概步骤就是这样弄得，都是按照说明书上一步一步做的，但做了好多次了，每次蛋白都留在BufferA中或Ni-NTA磁珠上，Elution Buffer 就是洗脱不下来，不晓得哪里出问题了，愁死人了

我是把一种菌液先用BufferA溶解，将蛋白释放出来，，然后通过Ni-NTA磁珠吸附6-his蛋白后，再用Wash Buffer洗三次，然后用Elution Buffer 洗脱三次，每次25微升，Buffer A：100mM 磷酸二氢钠，10mM Tris Cl，6M盐酸胍；
Wash Buffer的配置：100mM 磷酸二氢钠，10mM Tris Cl; 8mM 尿素；pH6.3;
Elution Buffer 与Wash Buffer配置相同，只是pH调为4.5
每次跑SDS-PAGE胶，发现目的蛋白只在BufferA中或Ni-NTA磁珠上（Ni-NTA磁珠最后加水，也跑一个泳道），Elution Buffer 液里就是木有，不晓得怎么回事呢

大概步骤就是这样弄得，都是按照说明书上一步一步做的，但做了好多次了，每次蛋白都留在BufferA中或Ni-NTA磁珠上，Elution Buffer 就是洗脱不下来，不晓得哪里出问题了，愁死人了

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ph洗脱很容易出问题，直接用500mM咪咗或者50mM EDTA肯定就有了

ph洗脱很容易出问题，直接用500mM咪咗或者50mM EDTA肯定就有了

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你的意思是只用咪唑或EDTA洗脱么？

如果在BfferA中说明没挂在磁珠上，而在NI磁珠没洗下来说明你的washing Buffer 浓度低了。

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这个washing Buffer 是按说明书上配的呢

这个washing Buffer 是按说明书上配的呢

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这个应该是标准的操作流程。但是在纯化过程中，不同的蛋白，即使都是NI标签，与柱子结合的程度也不同，washing BUffe的中咪唑的浓度需要做出相应的调整。不知道磁珠也会不会遇到这个情况？