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标题:【求助】做磷酸化抗体的WB时内参的选择

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发表于 2013-6-8 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做磷酸化抗体的WB时内参的选择


我打算做磷酸化抗体的WB，想请教一下，内参是选择普通的内参，如actin、GAPDH等，还是用非磷酸化的抗体。有的文献中是将磷酸化抗体的结果和非磷酸化抗体的结果的比值来对比的。我想知道能否只做磷酸化的抗体，，而不做非磷酸化的抗体(出于节省经费的原因)
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发表于 2013-6-8 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
都要做的吧 -我认为
内参可以起到作为体系的对照
非磷酸化抗体的结果本身在不同的条件下可能本身就有不同
不知道我说清楚了没有
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发表于 2013-6-8 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

普通的内参，如actin、GAPDH等和非磷酸化的抗体都要做。普通内参保证了western操作电泳上样量一致，排除体系本身的影响。将磷酸化抗体的结果和非磷酸化抗体的结果的比值作为某种刺激（药物作用）对信号通路中某种酶磷酸化程度的影响，这种表述实验结果的方法是最客观的，也是必需的。如果不做普通内参，不能说明最后实验结果（磷酸化抗体检测目的蛋白的变化）是因上样量不同而致还是因药物（外界刺激）作用而致。如果不做非磷酸化抗体，也可能本身药物（外界刺激）作用能够导致该蛋白量和磷酸化程度都有改变，对这种双重改变表现不出来，会直接影响后续结果的分析。

多多交流！
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发表于 2013-6-8 14:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般来说：修饰的蛋白，一定要做非修饰的蛋白，因为如果进行了处理，很有可能非修饰的蛋白量发生了变化，如果非修饰的蛋白都没有了，再做修饰的蛋白就没意义了，而且非磷酸化抗体的价格只有磷酸化抗体的价格的40%，强烈建议你买
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发表于 2013-6-8 14:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
万分感谢各位前辈，还有一个问题就是非磷酸化抗体显示的某种蛋白总的含量还是除了磷酸化蛋白以外的蛋白含量
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发表于 2013-6-8 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

几位前辈的话我是否可以这样理解：磷酸化蛋白的表达量增加不能说明磷酸化水平增加，只有磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白比值增加了才能说明磷酸化水平增加了呢？具体来说是：（磷酸化蛋白/内参）/(非磷酸化蛋白/内参)，对吗？
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发表于 2013-6-8 14:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得也可以做总的蛋白量，然后再做磷酸化蛋白的量。如总量不变，磷酸化的变了，也可以很说明问题吧
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发表于 2013-6-8 14:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得表达量和磷酸化水平的改变 应该分别讨论 分别具有不同的意义 应该分开来讨论 表达量升高了 磷酸化水平升高本身应该不矛盾吧
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发表于 2013-6-8 14:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也有个疑问，如果用目标蛋白的总蛋白抗体显示目标蛋白表达升高，再用目标蛋白磷酸化抗体显示磷酸化蛋白表达升高，这样不能说明该目标蛋白磷酸化水平升高吗？
再如果，用目标蛋白的总蛋白抗体显示目标蛋白表达升高，再用目标蛋白磷酸化抗体显示磷酸化蛋白表达升高，又用非磷酸化抗体显示非磷酸化蛋白表达也升高，这样也不能说明蛋白质磷酸化水平升高了？？
以上两个问题，有助于讨论，希望各位赐教！！谢谢
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发表于 2013-6-8 14:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果用目标蛋白的总蛋白抗体显示目标蛋白表达不变或下降，再用目标蛋白磷酸化抗体显示磷酸化蛋白表达升高，这样也能说明该目标蛋白磷酸化水平升高吧？
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