小中大【求助】westernblot的条带太淡是什么原因？
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各位高手，我最近为westernblot真是费尽了脑筋
我的主要问题是目的条带太淡，几乎看不见，不好分析，但又找不到原因，各种方面都考虑过了，也改进过还是没有很大的改善，
我跑的是肿瘤细胞株中抽提的蛋白，一抗最早用老板自己做出来的单抗是做得很好的，条带很清楚。我师妹也用这个单抗跑临床标本也跑得很好。但是由于仅有的单抗没有了，我只能买Santacruz的成品多抗，这种多抗我师妹曾经做过也很好，1：250稀释条带很明显。
但是现在我用这种多抗就是条带很淡，几乎看不见，同一批标本跟以前用单抗做出来的比都不能比。我已经做过N次改进：增加一抗的浓度到1：100；将PVDF膜改成NC膜；增加上样蛋白量，最高到100ug，而且为减少抽提蛋白过程中对蛋白的降解我直接用蛋白上样缓冲液裂解蛋白，但都只能使目的条带稍微增浓一点点，但还是几乎看不见。另外必须说明的是，我每次都同时做b-actin,用的是b-actin特异性的单抗，条带都非常明显，很亮。我真的没辙了，我把我的操作流程写在下面，请各位高手指点，哪一步还可以改进，怎样才能使我的目的条带明显。
1，蛋白抽提：2×106个细胞用2×loading buffer 30ul裂解，煮沸5min，取20ul上样。我的蛋白是60kd的
2。电泳：这步跟以前做出来时候的操作和用的试剂都一样。
3。转膜：用NC膜，冰浴，75V 2h
4。5%奶粉TBS封闭1h
5。一抗1：250结合过夜
6。TBS洗膜10min 3次
7：1：1000二抗结合2h
8。洗膜5min 3次——30min 3次
9。ECL显影5min
结果背景很高，就是一块黑的，目的条带非常不明显，只是隐约有
