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标题:【求助】包涵体复性与纯化

youreyes[使用道具]
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发表于 2013-6-8 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】包涵体复性与纯化

最近在做包涵体的复性与纯化，采用的是柱上复性的方法，可以得 到的蛋白沉淀了，请问柱上复性要注意些什么哟，出现沉淀后怎么办？
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-6-8 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

柱上复性不靠谱，先试试看快速稀释20倍看看能不能得到可溶的蛋白
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2013-6-8 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
柱上复性出现沉淀，可以再用尿素或盐酸胍把目的蛋白再溶解洗脱下来。
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youreyes[使用道具]
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发表于 2013-6-8 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
柱上复性不靠谱，先试试看快速稀释20倍看看能不能得到可溶的蛋白

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采用了稀释复性的方法，蛋白溶液浑浊出现沉淀，复性液有加L-Arg?
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2541[使用道具]
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发表于 2013-6-8 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
采用了稀释复性的方法，蛋白溶液浑浊出现沉淀，复性液有加L-Arg?

===================================

上清有蛋白么？可以过一个Q柱之类的浓缩一下
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youreyes[使用道具]
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发表于 2013-6-8 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上清有蛋白么？可以过一个Q柱之类的浓缩一下

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蛋白基本上都沉淀了。会不会是我的缓冲液用的不对，我用的是PBS
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youreyes[使用道具]
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发表于 2013-6-8 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白基本上都沉淀了。会不会是我的缓冲液用的不对，我用的是PBS

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你好，方便留qq不，有好多问题想请教，我是暨南大学的学生，初次遇到包涵体问题，这个问题困扰我一两个月了。希望不吝赐教！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-6-8 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1 蛋白质本身不稳定，缓冲液中加5%或者10%的甘油试试。
2 重新做个克隆，表达序列根据已有结构或者二级结构分析一下，N端或者C端去掉几个疏水性氨基酸，保留几个亲水性性氨基酸。
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lgm[使用道具]
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发表于 2013-6-8 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 个人感觉稀释20倍太小了，我一般稀释至80-100倍复性。缓慢滴加蛋白至复性液（最好加入L-Arg，Glycerol）,边加边快速搅拌。加完后四度缓慢搅拌12h。
2. 弄清目标蛋白的PI，很多实验室配制的PBS pH在6-7之间。试试不同pH的 buffer.
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youreyes[使用道具]
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发表于 2013-6-8 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位不吝赐教，在后面的实验中我将，慢慢摸索，当然的如果各位还有什么好的建议请给我留言，小女子谢过啦！
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