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标题:【求助】pet32a到底融合蛋白有多大

wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-6-8 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】pet32a到底融合蛋白有多大


pet32a到底融合蛋白有多大，前面有his－tag，trx－tag，s－tag共有400多个氨基酸，如果这样算起来应该有40多kd，我的酶切位点前面是bamhi，后面是salI。我的目的条带全长是1200bp。高手给我指点一下吧
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发表于 2013-6-8 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先要确定你插入的片断C端有没有终止子，如果有，那么trx－tag、his－tag、s－tag，DDDK酶切位点等融合片断一共大约为18KD，加上你的目的蛋白400AA，融合蛋白应该为62KD左右。
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 小中大
首先要确定你插入的片断C端有没有终止子，如果有，那么trx－tag、his－tag、s－tag，DDDK酶切位点等融合片断一共大约为18KD，加上你的目的蛋白400AA，融合蛋白应该为62KD左右。
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发表于 2013-6-8 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢，那我在不到20kd和40多kd有两条目的条带，那40多kd的是不是目的条带呢？
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-6-8 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你表达的目的融合蛋白经过纯化、EK酶切，那么20KD以下位置的条带是融合片断部分，40多KD带就是目标蛋白。
如果你做的是菌体电泳，不应该有这两条带，应该只是60KD左右带。
如果你的菌体经过破菌处理，取上清做电泳，那么可能会有融合蛋白降解形成20、40KD带。这时要考虑破菌条件，减少融合蛋白降解。

下次问问题请将条件说清楚，“不到20kd和40多kd有两条目的条带”是在什么情况下出现的。
祝表达成功！
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-6-8 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，我确实没有说清楚。我是全菌直接跑电泳，没有进行超声粉碎，然后转膜，用his抗体做western blot检测后，发现有两条条带，一条是20kd，一条是40多kd，而未诱导的全菌只有20kd的条带。这个怎么解释呢？
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-6-8 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

能否将你的电泳图和western blot上传看一下。
未诱导的全菌western也能显色20KD的带我没法解释，即使是基础表达也应该是和诱后一样，只是弱一些而已。
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发表于 2013-6-8 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在marker旁边是未诱导的全菌，其他是诱导后的。可看到在20kd、40kd有两条条带。
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-6-8 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚看到你的图，首先你的图照反了，我只有大致猜一猜。
所谓20KD的带在我看来完全可以忽略，和你的主带相比弱多了。
marker边上的诱导前菌的两条带应该不是，可能是相邻上样孔的溢出。
你的MARKER在最边上，所以条带扭曲，对应目标蛋白条带在你所说的40KD应该比这大，我认为就是融合蛋白60KD的带。
把你的电泳图也发上来看一看，别反了
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发表于 2013-6-8 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
顺便问一下，肠激酶酶切下的融合蛋白有多大？我的表达蛋白113aa，没有抗体，能分离出来吗？
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